基因治疗

CRISPR/Cas递送系统

细胞外囊泡EV

细胞外囊泡是纳米级的非病毒递送管道，可用于各种目的，其中之一是用作靶向递送系统。EV是由不同细胞产生的脂质包被颗粒，其目的用于是细胞间运输，如遗传物质和蛋白质。

EV可分为三大类：

1、微泡（MV）

2、外泌体

3、凋亡小体。

它们在包装能力、生物起源、功能和释放机制方面有所不同。其中，外泌体有30-150 nm的直径，是递送蛋白质和遗传成分(包括CRISPR/Cas系统)可信赖的选择（图1）。

图1. 利用EV进行CRISPR/Cas系统递送                                          Ahmadi et al.

可以从人体细胞中收集不同类型的EV，包括微泡，外泌体和凋亡小体。这些EV可以将蛋白质，DNA和不同类型的RNA从一个细胞携带到另一个细胞。这些外泌体可以被设计成靶向特定组织，同时携带我们所需的东西，如CRISPR/Cas系统。这种方法允许自体组织特异性基因编辑。

外泌体因用于癌症诊断和治疗而备受关注。从肿瘤细胞分泌的外泌体可能是肿瘤靶向治疗的极好选择，因为它们与其来源相似，因此更可能被细胞吸收。通过控制该特征，并将所需载物加载到肿瘤衍生的外泌体中，可以促进具有细胞特异性趋向性方法的癌症治疗。因此，一项研究表明，与单独使用药物相比，用称为Doxil的癌症治疗剂加载肿瘤来源的外泌体，并将其全部注射到起源组织中，可以促进肿瘤抑制。在一个相关的策略中，含有阿霉素的生物相容性多孔硅纳米粒子（PSiNPs），被称为DOX@E-PSiNPs，被引入分离的肿瘤细胞(图2)。之后，肿瘤细胞释放出的外泌体DOX@E-PSiNPs被系统地注射到小鼠体内，这些外泌体被大量癌细胞和癌症干细胞（CSCs）摄取，导致相当大的肿瘤抑制。外泌体在肿瘤细胞中用于CRISPR/Cas递送的潜力可以从它们递送选择性和高效递送系统的能力推断出来。

图2. 肿瘤来源的外泌体

如图2所示，在诱导肿瘤细胞产生外泌体的时候，用DOX@E-PSiNPs，CRISPR/Cas系统和病毒载体质粒转染肿瘤细胞，可以得到包裹我们所需载物的肿瘤来源的外泌体。由于这些外泌体起源于肿瘤，因此，可以收获它们，并将其系统地注射回肿瘤细胞中，用于治疗目的。

根据外泌体的效力，一项研究使用肿瘤衍生的外泌体将CRISPR/Cas9体内靶向递送到患有卵巢癌的SKOV3异种移植小鼠细胞中。研究人员比较了上皮细胞衍生的外泌体和癌症衍生的外泌体，以提供能够抑制聚（ADP-核糖）聚合酶-1（PARP-1）表达的CRISPR/Cas9系统。结果显示卵巢癌细胞显着凋亡，并且对顺铂的化学敏感性协同增强。两种治疗方法的结合导致57%的癌症增殖抑制，几乎是外泌体或顺铂单独治疗效果的两倍。关于使用外泌体介导的基因递送的一个严重问题，特别是在递送CRISPR/Cas系统的情况下，是对外周和远处组织产生脱靶的负面影响的可能性。

除了外泌体的包装能力外，将其设计为靶向递送载体是一个重要目标。Alvarez-Erviti及其同事从能够表达Lamp2b（一种外泌体膜蛋白，与神经系统特异性狂犬病病毒糖蛋白（RVG）融合）的工程树突状细胞中产生了携带短干扰RNA（siRNA）的脑靶向外泌体。这些外泌体在小鼠体内递送的结果显示出强大的治疗潜力，并且没有其他组织的非特异性摄取。另一项研究使用类似的方法，在软骨中递送miRNA作为骨关节炎的治疗方法，其在靶向硬穿透组织方面表现出显着的潜力。

坏死性凋亡是一种对病原体或炎症反应的坏死形式，其中，细胞经历非程序性细胞死亡。值得注意的是，在该途径中，应抑制参与细胞存活和凋亡的半胱天冬酶8和IAP1/2。在最近的一项研究中，研究人员设计了一种特定类型的肿瘤来源的外泌体，使其表面具有TNF受体（TNFR）配体。这些外泌体携带能够抑制胱天蛋白酶8和IAP1/2的CRISPR/Cas9系统；因此，在外泌体介导的TNFR信号传导激活和CRISPR/Cas9介导的胱天蛋白酶8和IAP1/2失活后，肿瘤细胞经历了坏死性凋亡（图3）。坏死性凋亡优于细胞凋亡的特点是前者也能激发T细胞消除剩余的癌细胞。

图3. 使用外泌体诱导坏死性凋亡。

如图3所示，表面带有TFNα的工程化外泌体，携带两种能够抑制cIAPs和caspase 8的CRISPR/Cas系统载体。在这种方法中，外泌体TNFα配体引发TNFR信号传导途径，其可以激活cIAP，推动细胞存活。CRISPR/Cas9介导的cIAP抑制与活性半胱天冬酶8一起导致癌细胞凋亡。此外，cIAP和半胱天冬酶8与TNFR信号传导的双重抑制导致坏死性凋亡。坏死性凋亡优于细胞凋亡的优点是前者也会激发T细胞消除剩余的癌细胞。

与病毒不同，外泌体可以修改大小。混合外泌体是细胞衍生的外泌体和合成脂质体的组合，已被开发用于携带大型载物，如CRISPR/Cas系统。混合外泌体不仅具有更大的包装能力，而且由于脂质体的正电荷，它们与带负电荷的RNA和DNA更有效地相互作用，通过膜融合吸收它们。这种方法可以通过电穿孔等机械方法消除将遗传物质加载到外泌体中的需要。值得注意的是，这种外泌体的改变对其细胞类型趋向性和摄取的效率没有影响。Lin及其同事已经使用这种方法将CRISPR/Cas9表达载体有效地传递给难以转染的间充质干细胞（MSCs）。

外泌体也可以用DNA适体（一种短的合成寡核苷酸）进行优化，以使用外泌体作为靶向递送系统。DNA适体具有成本效益，易于获得，对免疫系统无刺激性；因此，使它们成为抗体或其他探针的合适替代品。最近的一项研究使用胆固醇锚定的价控四面体DNA纳米结构（TDNs）与外泌体表面的DNA适体结合，在体外，离体和体内选择性地将抑制WNT10B基因的CRISPR/Cas系统递送到肝细胞癌细胞中。通过这种方法，在肝细胞癌细胞中靶向基因抑制的结果良好，这突显了EV作为CRISPR/Cas系统的标记和靶向递送系统的潜力。

有核细胞衍生的EV介导的水平基因转移的风险可以被视为EV的限制，尽管红细胞衍生的EV绕过了这一安全相关问题。由于红细胞是无核的，因此O血型红细胞可以用作无DNA EV收获的通用来源。RBC-EV已在体内和体外用于递送CRISPR/Cas9，显示出高转染效率且没有可检测的细胞毒性。此外，Pham及其同事报告说，RBC-EV可能成为选择性交付载物的目标。因此，他们通过分选酶A和OaAEP1连接酶将表皮生长因子受体（EGFR）靶向肽与携带紫杉醇的EV缀合。结果表明，EVs可以有效地将化疗药物递送至EGFR阳性肺癌细胞，引起明显的细胞凋亡并缩小肿瘤。推断靶向RBC-EV将CRISPR/Cas9系统递送至特定癌细胞的巨大潜力是合理的。

EV，特别是肿瘤衍生的EV已被证明在基于CRISPR/Cas的癌症治疗中绕过肿瘤防御机制非常有效。它们有不同的大小，可以包含不同的遗传物质。这些品质以及许多其他特点，包括易于操作，可靠的基因传递和高安全性，使EV成为强大的癌症治疗武器。

Vexosomes：外泌体包裹的病毒载体

外泌体包裹的病毒载体或vexosome是一种新型的基因传递方法，它赋予病毒载体以增强基因治疗的外泌体特征，例如广谱的细胞趋向性，几乎非免疫原性和可扩展性。Vexosomes的产生需要用编码病毒基因组的质粒感染包装细胞。细胞的细胞质富含产生的病毒基因组和蛋白质，这些蛋白质被质膜、内体和吞噬体中的细胞受体识别。因此，EV在从细胞分泌时封装病毒成分。Saari及其同事使用这种方法生产携带溶瘤AAV成分（AAV/EV）的无衣壳EV载体进入癌细胞。Vexosomes尚未用于递送CRISPR/Cas系统，尽管它们结合病毒载体和EV特征的潜力有望用于有效的基因编辑。

通过在其表面上包括靶向肽，可以修饰AAV/EV以更有选择性地递送基因。多项研究报道了在体内和体外使用靶向AAV/EV的益处；例如，Wood等人报道，这些载体可以通过血脑屏障并有效转导神经细胞。AAV的不同血清型，包括AAV1，AAV6和AAV9，已分别用于将转基因靶向递送到耳蜗和前庭毛细胞，神经元和少突胶质细胞中。它表明了这种基因传递到各种细胞类型的方法的兼容性。

封装AAV的EV可以用作特洛伊木马，以规避针对病毒载体的预先存在的免疫力。在这种情况下，最近的一项研究系统地将AAV9/EVs注射到对AAV9具有预先存在的免疫力的小鼠中，结果表明成功逃避了免疫系统。此外，这种方法表明，它可以减少有效递送载体所需的注射次数，降低AAV诱导的细胞毒性的风险。尽管这种递送方法具有优点，但尚未将其作为CRISPR/Cas系统的递送方法进行探索。

结合EV和病毒载体的力量和潜力，有望在基因传递领域拥有广阔的前景，特别是对于CRISPR/Cas传递。由于这种方法是新的，研究人员将更有兴趣探索其作为癌症治疗的全部潜力。

在体内或体外将CRISPR/Cas系统递送至靶细胞有其自身的挑战。为了解决它们，已经使用了不同的递送系统，包括物理方法，病毒载体，细胞外囊泡，纳米复合物等。其中，病毒载体和EV是注定要递送其遗传货物的非合成和天然系统。近年来，这两个真正的系统已经结合在一起，产生了一种称为vexosomes的新型载体。总体而言，递送系统的进步为基于CRISPR/Cas的有效癌症治疗带来了光明的前景。

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