高灵敏度！LAMP-Cas12b数字化核酸定量检测系统

作者：Magigen

CRISPR Cas系统目前被用来开发基于核酸的分子诊断工具，这是一种快速、灵敏的病原体检测方法。然而，大多数基于CRISPR-Cas的检测方法缺乏定量检测的能力。

在这里，新加坡MIT研究院的研究人员开发了一种热启动快速数字CRISPR Cas检测方法（WS-RADICA, Warm Start RApid DIgital Crispr Approach），它利用环介导LAMP扩增技术、CRISPR Cas12b蛋白、商用数字芯片，实现了对核酸的快速、灵敏和定量检测。该方法采用热启动方式，将一管以RT-LAMP试剂和CRISPR Cas12b蛋白为基础的试剂分散到数千个纳升或亚纳升的反应孔中，通过计算荧光阳性孔与所有反应孔的比值得到定量结果。RT-LAMP试剂的热启动活性可防止样品在分割前在室温下被扩增，可以实现精确的数字量化。研究人员以SARS-CoV-2核衣壳蛋白（N）基因为靶点，建立了这种验证方法。在60ºC水浴锅的环境下，针对SARS-CoV-2 RNA, 该方法可在40分钟内实现定性检测，60分钟内完成定量检测，检测SARS-CoV-2 RNA的拷贝数最少可以达到1copy/uL。此外，WS-RADICA方法经过改造，可以很容易地适应各种数字设备。研究人员利用两个数字设备对新冠病毒COVID19的DNA和RNA进行了定量评估，DNA检测结果是：线性动态范围为0.8-12777拷贝/µL, RNA的检测结果是：1.2-18391份拷贝/µL，两个R2值均大于0.99。对于WS-RADICA方法来说、RT-qPCR和RT-dPCR反应性能相当。WSRADICA法的敏感性和对抑制剂的耐受性均优于整体RT-LAMP-Cas12b方法。与其他方法相比，WS-RADICA显示出更高的速度和灵敏度，并且耐受抑制剂；因此，这种LAMP扩增与Cas12b蛋白配合，并结合数字设备的检测方法为核酸定量检测提供了一个有吸引力的选择。

实验材料

本研究中的引物、crRNA和FQ报告子是通过整合DNA技术合成的。含有来自每个病毒基因组（SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV）的N基因的质粒购自integrated dna Technologies。从Twist Bioscience（Genbank ID:MN908947.3）购买了覆盖SARS-CoV-2病毒基因组99.9%碱基的合成RNA。CRISPR-Cas12b购自美格Magigen Biotechnology。用dPCR或RT-dPCR法测定DNA和RNA含量。

RT-LAMP, cas12b, WS-RADICA, 反应原理图

图1.WS-RADICA原理示意图

A. WS-RADICA过程概述。

先从不同类型的样本中提取核酸（DNA和RNA），然后将RT-LAMP试剂、Cas12b蛋白、crRNA、FQ报告子混合物混合。反应混合物可通过数字芯片细分成数千个小分区，然后在60℃下培养1小时。含有目标序列的分区比没有目标序列的分区产生更高的荧光信号，并通过荧光检测器检测端点结果，计算出阳性分区的比例。

B. 阳性分区中的反应。DNA/RNA、RT-LAMP试剂、Cas12b蛋白、crRNA、FQ-reporter在每个分区中都是一次性混合。RT-LAMP恒温扩增试剂可将靶DNA/RNA扩增成环状结构。由于扩增的靶点与crRNA互补，它们与Cas12b/crRNA复合物结合，触发Cas12b蛋白的反式切割功能，从而切割FQ报告子，进而产生荧光信号。

C. 批量RT-LAMP-Cas12b反应与数字化RT-LAMP-Cas12b反应的比较。

详细研究报告请参阅

A Warm-start Digital CRISPR-based Method for the Quantitative Detection of Nucleic Acids