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CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农作物品种改良中的应用

作者:平文丽来源:河南省农业科学 院烟草研究所

CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR/Cas9在农作物改良中的应用

引言

基因组编辑技术是近些年新发展起来的一种对基因组进行精准修饰的技术,它能在基因组上进行定点突变、定点插入或删除、基因置换、在两位点或多位点同时定点突变或小片段缺失等操作,已经成为目前发育生物学中的重要工具。该技术可以用于系统地研究基因、调控元件在特定生理或发育过程中所起到的作用,或者用于作物性状的定向改良。

最初,科研人员主要采用同源重组介导的打靶技术对模式生物的基因组进行编辑。但编辑效率不理想,限制了基因组编辑技术的应用四。后来研究者对核酸内切酶进行人工改造,用改造过的人工核酸内切酶,在基因组特定位置上制造DNA双链断裂,借助断裂的修复过程,对生物基因组进行定点编辑。

该技术的基本原理是:以DNA结合蛋白(锌指蛋白、类转录激活因子效应物或者后来出现的成簇规则间隔的短回文重复序列CRISPR)与核酸内切酶Fok I融合成人工核酸内切酶(ZFN4、TALEN或者CRISPR/Cas9)为工具,在基因组的特定位置打断DNA双链、制造双链断裂(DSB);双链断裂会借助细胞自身的修复系统,采用非同源末端连接(NHEJ,non-homologous end joining,无需修复模板,可能出错),或者同源定向修复(HDR,homology-dependent recombination,需要修复模板)的方式进行修复;在HDR方式的修复重组的过程中,提供含外源片段的修复供体,即可引入预设突变,对基因组进行定点编辑,具体过程如图1所示。ZFN及TALEN技术程序较复杂、效率较低,在一定程度上影响了基因组编辑技术的应用。


CRISPR-Cas9系统的作用机理1.jpg

图1 靶向酶介导的基因组编辑


CRISPR/Cas9系统能利用一段小RNA来引导识别靶序列,并用核酸内切酶剪切DNA以降解外来遗传物质。只需要通过改变这段引导RNA,就可以使CRISPR/Cas9定位到新的DNA序列上。该技术用CRISPR/Cas9构建针对特异基因片段的载体,比原有的ZFNS和TALENS手段更为简便、易操作,大大降低了基因组编辑技术的门槛,已经应用于人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐形线虫、植物及细菌等生物中。这一项具有划时代意义的新技术在短短几年的时间内就成为靶向基因组编辑的“标准工具”。随着研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术的编辑效率也在不断提高,应用范围也在不断拓宽。目前,科学家能使用多个引导RNA,同时导入或编辑多个基因;或者将dCas9(dead Cas9,失活的Cas9)与负责转录调控的蛋白相融合,可以对靶基因在转录水平进行调控(包括抑制或者激活):将对特定序列的调控蛋白模块与基因组或表观基因组的修饰酶相融合,即可实现对基因组进行动态控制。CRISPR-Cas9介导的基因组编辑策略将继续加速功能基因组学的研究,不仅将使遗传工程改头换面,而且也将给生命科学研究的其他领域带来巨变。本综述将介绍该技术的出现、机理与改进,并讨论该技术在植物品种改良中的应用以及未来的发展前景。


1.1 概述

CRISPR/Cas系统介导的基因组编辑技术,是一种对基因组进行高效定点修饰的技术,该技术的开发与发展基于细菌和古生菌中CRISPRCas系统相关的数十年的基础生物学研究。1987年,日本学者Ishino等首先在研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因(iap)的序列和功能时,在其下游UTR区(非翻译区)发现被32nt的非重复序列所间隔的、间隔排列的“串联重复序列,但当时并不清楚这些序列的生物学意义。后来随着越来越多基因组测序的完成研究者发现,在细菌、古生菌中的基因组中广泛存在这种间隔排列的串联重复序列I。

2002年,Mojica及Jansen等将间隔排列的串联重复序列命名为“成簇规律间隔短回文重复列”(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, CRISPR),并鉴定出了位于同一基因簇的CRISPR附属蛋白(CRISPR-association proteins,Cas),将CRISPR基因簇分为I型、II型、Ⅲ型3种类型,但并未揭示其生物学功能。

2005年,多个生物信息学研究小组同时发现,CRISPR的间隔序列(spacer)总是与外源入侵的菌体或者质粒的DNA序列互补或者匹配,推测CRISPRCas系统的功能可能与抵御外源遗传物质入侵的免疫保护机制有关。

2007年,Barrangou等对嗜热链球菌进行遗传改造,发现插入或删除几个与噬菌体序列互补的间隔序列DNA片段,就能改变细菌对噬菌体的免疫力,首次通过实验证明嗜热链球菌的CRISPR/Cas型系统直接参与细对噬菌体的适应性免疫反应,具有“获得性免疫系统的生物功能,并指出间隔序列参与指导外源DNA的识别,Cas蛋白则负责获得间隔序列、降解外源菌体的DNA。

随着研究的进一步深入,2010年发现,型CRISPR/Cas9系统比其他CRISPR系统更简单,只需要 Cas9蛋白(核酸酶)、成熟的 crRNA(CRISPR derived RNA)、tracrRNA(trans-activating RNA)及RNase III 4种组分,即可对特异序列的外源DNA进行识别、剪切。

2012年,Jinek研究组将细菌的II型CRISPR系统进行了改造和优化四,将crRNA和tracrRNA连接成一条单链引导RNA(single-guide RNA,sgRNA),并用实验证明,它能够高效介导CRISPR/Cas9蛋白对DNA的定点切割;随后,CRISPR/Cas9被开发为RNA靶向的基因组编辑工具,并在多种真核生物中成功对基因组进行了修饰(包括删除和插入,激活或抑制基因转录)。

2013年,《Science》、《Natur Biotechnology》等多个期刊先后发表了几个独立研究组的研究结果,证明Cas9系统能在人类、小鼠等多种生物的细胞中进行有效的靶向酶切、定点编辑,其效率与TALEN酶切效果相当。文章还证明,多个靶点可以同时进行靶向酶切。多年研究工作的积累,使得CRISPR/Cas9技术迅速发展、不断改善,变得越来越简便、高效。目前CRISPR/Cas9系统已经能进行多个基因的同时敲除、敲入,并在模式动物遗传操作、作物遗传改良、遗传缺陷的临床治疗、药物开发以及工业生物工程等包含农牧渔业医疗的多个领域均得到了广泛应用。


1.2 CRISPR-Cas9系统的作用机理

CRISPR-Cas系统的组织结构相对简单,由CRISPR位点与附近4~10个与CRISPR相关的Cas蛋白的编码基因串联排列组成。典型的CRISPR位点由保守的同向重复序列(directed repeats)、长度不等的间隔序列(spacers)以及位于5’端的前导序列(leader sequcnce)按顺序排列组成。其中,间隔序列来源于外源基因片段即原间隔序列(protospacers),间隔序列与同向重复序列依次串联排列,可以拥有2~100个重复。CRISPR位点被转录为pre-crRNA(precursor CRISPR RNA),然后被加工为短的CRISPR RNAs (crRNAs),指导Cas蛋白与外源入侵片段的识别与降解。Cas基因则主要编码核酸酶、DNA解旋酶、聚合酶等与切割、修饰核酸相关的蛋白。在进行基因组编辑时,CRISPR-Cas9系统起作用的主要是2个部分:是嵌合的引导RNA(gRNA,chimeric guide RNA),在识别靶序列的过程中起决定性作用:另一个是具有核酸酶活性的CRISPR-Cas9蛋白,Cas9上的几个特异碱基,即前间隔相邻基序(protospacer adjacent motif,PAM)也参与识别靶序列。PAM序列是有物种特异性的,不同细菌中序列不同。目前在基因组编辑中,应用最广泛的是Streptococcus pyogenes Cas9(Magigen SpCas9),它的PAM序列是5'-NGG-3.


CRISPR/Cas9系统作用机理可以大致分为3个步骤。

(1)系统中高度可变的CRISPR间隔序列的获得(spacer acquisition):当外源菌体或质粒等的遗传物质入侵细菌等时,CRISPR/Cas9系统识别PAM序列,然后,特定的Cas蛋白将PAM旁的“原型间隔序列”加工成为间隔序列、整合到细菌基因组的CRISPR位点上,这些间隔序列被同向重复序列隔开,保证了CRISPR系统对自身序列和外源序列的正确识别。


(2)CRISPR位点的表达即crRNA的合成与加工:CRISPR转录为pre-cRNA初级转录本,之后与tracrRNA结合成tracrRNA:pre-crRNA双链复合物,然后被核糖核酸内切酶RNase III加工后成熟,形成crRNA(由一个间隔序列与部分重复序列组成)1。

(3)CRISPR/Cas系统对外源遗传物质的识别与降解,即免疫干扰。根据参与蛋白与识别机制的不同,CRISPR/Cas系统可以分为I、II、III 3种类型,其中在基因组编辑技术中应用最为广泛的是II型CRISPR/Cas系统中的CRISPR/Cas9。


CRISPR/Cas9系统的作用机制是:

噬菌体或质粒等侵染后,外源遗传物质片段整合到寄主基因组的CRISPR位点引导序列的近端,同时重复序列也复制1次:获得新的间隔区后,转录成pre-crRNA,然后加工后形成包含了间隔序列的crRNA,并与tracrRNA配对形成复合体:进一步加工后,crRNA-tracrRNA复合体与Cas9蛋白一起搜寻目标DNA序列:最后,由Cas9蛋白发挥核酸酶活性,切割、降解与间隔序列互补的外源DNA,具体的免疫过程如图2所示。


II型CRISPR-Cas9系统获得性免疫机制示意图1.jpg

图2. II型CRISPR/Cas9系统获得性免疫机制示意图


2. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑


CRISPR/Cas9基因组编辑技术的基本步骤及其原理

(1)分析待改良的性状,确定目标基因(即靶基因):

(2)根据靶基因DNA序列,构建内切核酸酶表达基因盒,并将其导入合适的表达载体中:

(3)选择合适的受体,通过合适的遗传转化方法,将内切核酸酶基因表达盒导入目标受体:

(4)在受体中,Cas9-gRNA复合体对位于PAM序列上游的目的基因进行识别,然后对靶DNA双链进行特异性切割:

(5)DNA双链断裂后诱发植物体内的NHEJ或者HDR修复机制,对靶基因进行定点突变、删除,或者定点插入外源片段。

CRISPR/Cas9技术的关键是gRNA的设计,gRNA的设计对Cas9的活性与效率有显著影响。合适的gRNA能对含有PAM序列的任一靶DNA序列进行敲除、插入或定点突变等定向修饰。

现在一般将crRNA(与靶DNA互补)与tacrRNA融合在一起,形成一条单独的sgRNA,gRNA的5'端包含靶DNA的互补序列,3'端包含tacrRNA:crRNA的类似序列:gRNA上的靶DNA的互补序列可以定位目的位点,tracrRNA:CrRNA的类似序列与Cas9结合。与双引导RNA相比,sgRNA引导具有更快的编辑速度。

影响CRISPR Cas9编辑效率的主要因素包括gRNA的选择,靶DNA的序列、Cas9以及gRNA的表达定位等。因此在设计CRISPR/Cas9系统时,应该综合考虑各种影响因素,提高编辑效率。目前,用于提高基因组编辑效率的策略包括:将靶DNA互补的crRNA与tracrRNA融合为一条sgRNA以提高引导效率:在设计靶DNA时要在3端含有PAM序列:在专用软件及数据库的辅助下,选择合适的靶序列和启动子(如内源的组成型表达的启动子)驱动Cas9基因的高效表达:对Cas9基因进行密码子优化、提高Cas9的表达量:采用合适的遗传转化法,或在Cas9蛋白上加特定的核定位信号(nuclear localization signal,NLS),使其能顺利导入目的生物,并在特异的细胞器顺利表达。


3. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在植物品种改良中的应用

自CRISPR/Cas9系统被开发为基因组编辑工具后,很快就成功应用于人类、小鼠、斑马鱼、家蚕、果蝇、酵母等多个物种中。但直到2013年,中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞实验室才首次将该技术应用到水稻、小麦中,证明了CRISPR/Cas9系统能够应用于植物基因组编辑中。之后,多位研究者在植物基因组编辑中,通过对Cas9密码子进行优化、采用植物内源的组成型启动子等手段,显著提高了Cas9的表达量,并提高了基因组编辑的效率。此外,研究者还对Cas9蛋白进行适当的修饰(加上信号肽,或标签蛋白),以提高基因组编辑效率。目前为止,该系统已经对拟南芥、水稻等进行基因组编辑,并获得了稳定的突变植株:并在烟草、大豆、甜橙、小麦、高梁、玉米以及地钱等多种植物的原生质体或叶片等瞬时表达系统中进行了基因组编辑,通过表达GFP等报告基因,验证了CRISPR/Cas9系统在植物细胞中进行基因组编辑的可行性。

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在植物中的应用主要涵盖以下几个方面:

应用于植物功能基因组学研究,筛选、鉴定与重要性状相关的基因:应用于农作物品种改良,帮助育种家更准确而快速地设计、改造作物品种,有针对性地利用CRISPR/Cas9系统来整合优良基因、聚合多个优良的农艺性状,提高植物的抗病性:、提高产量:或者提高目标成分含量以改良品种品质。目前已经有数位研究者对CRISPR/Cas9在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草和甜橙等多种植物中的应用情况做了综述,阐述该技术在这些植物的基因组编辑中的应用,分析基因组编辑效率的影响因素,解读CRISPRCas9系统的特异性、脱靶效应和编辑效率,阐述CRISPR/Cas9技术存在的问题与可能的解决方法。


4. 展望

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术在生物技术、基因组定向改造方面存在明显的优势:只需要根据靶基因序列设计出gRNA,即可实现对基因组的定点编辑,实验操作简单且周期短,编辑高效、通用性广,花费也不高。在对动物的研究中,Rudolf Jaenisch教授用CRISPR/Cas9技术,将携带多基因突变(5个)的小鼠的实验周期从3~4年缩短至3~4周内,证明CRISPR/Cas9技术甚至可能比传统方法还要简便。Xie等将内源tRNA加工系统改造成为一个简单有效的平台,用于合成、精确加工包含tRNA-gRNA结构的单顺反子基因,产生大量携带正确靶向序列的gRNA,引导Cas9编辑多个染色体目标。这一策略大幅提高CRISPR/Cas9的特异性和编辑能力,能够在稳定的转基因水稻中,高效(可达到100%)实现多重基因组编辑和染色体片段删除。

此外,CRISPR/Cas9介导的多基因敲除及染色体重排,可以用于研究植物复杂基因功能、长链非编码RNA、基因调控序列及基因簇功能。此外,也为染色体水平上改造植物提供了可能。可以预见,CRISPR/Cas9技术将在植物功能基因挖掘、品种定向改良、针对性地剔除感病基因,或者对其进行“定点修复”、花粉或花药发育相关基因定点突变及人工创制隐性核雄性不育材料、创制新的种质资源等领域得到广泛应用,将有助于加快培育更优质、高产、多抗性的农作物优良品种。

当然,该技术也存在一定局限性。

(1)存在脱靶效应,可能引起基因组非靶向位点的突变,把无意义的片段带入靶向基因组中,增加了研究结果的不确定性,

(2)部分学者认为CRISPR/Cas9技术的靶向编辑的效率仍然不够理想。针对CRISPR/Cas9技术“存在脱靶效应”及“表达效率不够理想”的局限性,研究人员也在探索对CRISPR/Cas9整套表达系统进行深入研究和优化,以期能够提高特异性、降低脱靶率。

未来的探索方向包括:拓展Cas9的应用范围,将其应用在经济作物品质改良中:在Cas9和sRNA加上核定位信号促,使它们在细胞核内特异表达:对比不同来源的各种启动子(比如H1启动子、拟南芥U6启动子、烟草U6启动子、UBI启动子、35S启动子等)的靶标范围、精准度和表达效率,选择适用于目标植物的启动子:寻找改造甚至突破 PAM序列“NGG"限制的方法:采用植物偏好的密码子优化Cas9酶,或者解析Cas9蛋白结构,并对酶本身进行改造,使其只能识别所有核苷酸都完全匹配的靶位点,提高其特异性:针对多倍体作物或者多基因控制的性状,设计能同时突变多个靶标基因的sgRNA;甚至可能构建在不同物种中通用的Cas9与sgRNA导入与表达系统、更有效地激活同源重组修复等;另外还需要在系统研究后,建立对脱靶效应进行全面准确评估的评价体系,**限度地降低可能存在的脱靶效应、提高CRISPR/Cas9的特异性和编辑效率:分析Cas9对基因组的编辑是否能遗传到后代中并稳定表达,符合怎样的分离规律,是否会在后代中产生新的突变表型。

这些研究都将有助于利用CRISPR/Cas9对基因组进行更精准高效的调控、创造更符合期待的性状。随着基因组编辑技术的发展,人工寻找靶位点、设计sgRNA已经不能满足研究的需要。目前已经有专业的软件,如Cas-OFFinder、SureDesign(由安捷伦公司开发)等,用于寻找CRISPR/Cas9脱靶位点、设计sgRNA。以后,随着生物信息学在基因组编辑中的应用的增多,可能会开发出更多的工具软件或者在线分析平台,辅助科研人员从一段基因序列或者从在线的基因数据库中快速筛选特定基因序列所包含的所有CRISPR/Cas9靶点,然后有针对性地设计sgRNA,并根据各种影响因素对突变频率的影响,提示软件用户避开可能脱靶的位点、选择突变效率较高的位点,以便研究者从中选择**的sgRNA、靶位点,从而降低甚至消除脱靶现象。

随着CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术特异性及编辑效率的提高,该技术在作物品种改良中将应用得越来越广泛。尤其是对于“烟草”等因为国际贸易限制而不允许转基因的作物而言,采用CRISPR/Cas9技术可以对靶基因进行特异编辑,产生性状定向改变,但不含外源基因的作物,其相关产物(如烟叶)中也不含外源基因片段。在验证其安全性的基础上,推广这种经过“基因组编辑”的烟草可能更容易被消费者接受。理论上它不会带来健康或环境方面的风险,但对于这种采用基因组编辑技术获得的植物是否应该受到转基因相关法律的约束,美国和欧盟的态度不一致,目前国际上尚无定论,还需要社会伦理及法律等领域进一步的讨论,以便制定合理的法律法规,规范基因组编辑产生的品种的释放。


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化学修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶(带基础 buffer)A017S250U, 5U/µl385
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CRISPR Cas9C002S70pmol/盒489
CRISPR Cas12bC006S100pmol/盒1480
CRISPR Cas13aC005S100pmol/盒1280
CRISPR Cas14aC015S100pmol/盒1280
T7 Endonuclease IC007S250U/盒549
单链DNA荧光报告探针C009S50 test139
单链RNA荧光探针C011S50 test239
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2X LAMP Amplication Mix(with dye)F001S50T1299
鼠尾基因型鉴定试剂盒A010M100次498


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