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利用CRISPR Cas碱基编辑技术治疗成人肝脏疾病作者：Magigen来源：Nature 纠正遗传性肝病的基因编辑有望用于未来的治疗干预，但缺乏有效和安全地将基因编辑机制递送至肝细胞，使其临床应用复杂化。 现在有两项研究报告了向非人类灵长类动物肝脏的有效递送，为遗传性高胆固醇血症的新型治疗提供了概念验证。 这两项研究成果分别是： 1. Rothgangl等人，猕猴中PCSK9的体内腺嘌呤碱基编辑可降低LDL胆固醇水平，In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels。 2. Musunuru等人，PCSK9的体内CRISPR碱基编辑可持久降低灵长类动物的胆固醇，In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates CRISPR Cas基因编辑技术是一种革命性的DNA编辑技术，在生物医学研究、农业和食品工业中有着广泛的应用，在治疗应用中具有巨大的潜力。 CRISPR基因组编辑依赖于核糖核蛋白复合物的靶向，改研究所指的核糖核蛋白复合物含有向导RNA分子，利用CRISPR Cas蛋白，靶向复合体的相关目标基因区域。 野生型CRISPR Cas蛋白在靶区域引入双链断裂DSB，其在体细胞中将主要通过有效但容易出错的非同源末端连接来修复。与靶区域同源的供体模板的共同递送促进了准确的同源性定向修复，但效率较差。 双链断裂DSB有内在风险，例如p53的激活和潜在的染色体易位，人们希望使用“侵入性”较少的基因组编辑，例如使用引入单链DNA断裂的CRISPR Cas切口酶Casnickase，这是体内更为安全基因治疗选择。 现在，Rothgangl团队和Musunuru团队最近发表的两篇论文使用后一种方法，采用Cas9nickase靶向DNA腺嘌呤脱氨酶（ABE），一种催化腺嘌呤→胍转化的酶，可以高效率地在肝细胞中特异性地在前蛋白转化酶subtilisin/kexin type 9（PCSK9）基因的**个剪接供体位点引入点突变。 在猕猴中，单剂量施用同时包含PCSK9向导RNA和ABE–Cas9nick mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）制剂会导致对剪接位点的编辑，从而导致异常剪接、活性PCSK9表达的丢失，这是一种肝细胞产生的血浆蛋白，可调节肝脏和胰腺中的LDL受体（LDLR）丰度（图1）。
图1. 利用脂质纳米颗粒递送，在猕猴肝脏中进行治疗性碱基编辑。 Rothgangl等人在肝脏中获得了26%的碱基编辑效率，使血浆PCSK9和LDL胆固醇水平分别降低了32%和14%；由于对ABE和CRISPR-Cas9蛋白的免疫应答，重新给药无效。 Musunuru等人在肝脏中建立了63%的碱基编辑效率，效率提高，这与血浆PCSK9和LDL胆固醇水平分别平均降低81%和65%的情形相吻合，所有这些在8个月的时间内都是稳定的。 Musunuru团队研究中较高的效率可能归因于使用不同的ABE和LNP配方。以前的研究表明，在小鼠模型中使用腺相关病毒AAV进行传输，Cas靶向的碱基编辑有望治疗单基因肝病。 然而，大尺寸的CASnickase–ABE编码构建体需要通过两个AAV载体递送，只有在共转染肝细胞后才能诱导碱基编辑。 目前的研究已经前进了一大步，研究证明，通过LNP递送至肝脏的ABE的瞬时表达不仅在敲除基因方面非常有效，而且似乎非常安全，至少在动物中是这样，两项研究均表明该方法非常适合治疗家族性高胆固醇血症，也可能治疗其他严重的单基因肝病。 当将严重的单基因肝病作为基因治疗的候选治疗对象时，与有毒代谢产物积累相关的肝脏疾病可以通过持续的底物减少来治疗。 一个例子是遗传性酪氨酸血症1型 hereditary tyrosinaemia type 1，通过敲除小鼠中的4-羟基苯基丙酮酸表达，来中断酪氨酸降解途径，可以防止有毒琥珀酰丙酮的积累。 1型原发性高草酸尿症是另一位候选疾病。在相关小鼠模型中敲除乙醛酸氧化酶，可防止乙醛酸盐的产生，乙醛酸盐是草酸盐的前体，导致高草酸尿症患者的肾损伤。可以通过CRISPR向导的基因失活来治疗此类疾病，可以替代终生药理干预的方法。 大多数遗传性肝病不能通过基因失活来治疗，而是需要纠正致病突变基因。尽管一些基因突变更为频繁，但大多数遗传性肝病是罕见的疾病，具有异质性突变模式。 鉴于大多数肝脏疾病中确定的致病突变数量，针对每种突变的向导RNA的设计和全面分析是一项重大挑战。 肝脏疾病的临床基因治疗试验依赖于在肝脏特异性启动子后面递送含有正确基因拷贝的基因治疗构建体。该基因添加疗法的主要优点是，无论怎样的突变，单个构建体均可用于治疗所有患者。 AAV介导的针对没有肝损伤的肝脏疾病的基因添加疗法已被证明是安全的，并可为成年人提供长期矫正。 使用这种方法，已经成功治疗14例的导致B型血友病的IX因子缺乏症，这是首次成功案例。 目前，这一策略正在A型血友病，氨积累（OTC缺乏症）和高胆红素血症（UGT1A1缺乏症）等各种肝病患者的小组中进行测试。 然而，由于AAV没有整合到宿主基因组中，因此这种疗法对于新生儿和持续肝损伤患者的肝病的治疗效果较差。 在这些情况下，AAV介导的基因添加或校正受到肝细胞增殖的阻碍，从而导致治疗载体的丧失。 因此，在这种肝脏疾病中要成功添加基因需要将治疗构建体整合到宿主基因组中。 然而，转基因在基因组中的随机整合可能引起遗传毒性，而靶向递送至安全基因座需要同源修复，其在体细胞中缺乏功效。 因此，体内碱基编辑可以提供优于非整合和整合基因添加疗法的优越替代方案，以治疗严重的遗传性肝病，为终身矫正提供更安全的选择。 基因编辑工具的快速发展，扩大了可以靶向的基因组序列，缩小了基础编辑器的编辑窗口，降低了脱靶效应的风险， 在不久的将来，这种方法确实可以用于近90%的疾病引起的突变。 当前的法规和临床试验设计使得现在很难进行突变特异性治疗，而这种治疗的最终目的是实现个性化治疗。 我们需要可负担得起的治疗方法来，用少数患者来确定安全性和有效性，以使患者特异性基因组编辑成为真正的可行基因治疗手段。 基因编辑的临床潜力还需要设计新的解决方案来针对法律监管和治疗费用。 参考文献 In vivo adenine base editing of PCSK9 in macaques reduces LDL cholesterol levels In vivo CRISPR base editing of PCSK9 durably lowers cholesterol in primates 相关阅读 |
