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改进CRISPR/Cas12i变体Cas-SF01提高基因编辑工具效率

作者:基因编辑

CRISPR基因编辑技术

CRISPR/Cas12i

CRISPR-Cas基因编辑技术已经经过了十年的发展,真核生物基因编辑技术正得到广泛的的应用。然而,天然Cas系统表现出低效率,限制了它们的应用。

但蛋白质工程已成功地提高了Cas核酸酶的性能,包括提高编辑效率、拓宽原间隔区相邻基序(PAM)范围和减少脱靶效应。

CRISPR/Cas12i属于V-I型Cas系统,由于其一些成员的基因编辑活性以及与CRISPR-Cas9和Cas12a相比其较小的蛋白质大小而引起关注。

最近,Zhang等人发现了一种新的核酸酶Cas12i3,并通过蛋白质工程产生了一个健壮的版本hfCas12Max,。然而,部分Cas12i 核酸酶的特征仍存在进一步开发的机会。


2024年1月7日,国际**期刊《The Innovation》发表了南方科技大学朱健康院士研究组标题为“An engineered Cas12i nuclease that is an efficient genome editing tool in animals and plants”的研究论文。该研究通过结构设计和蛋白质工程来优化未表征的Cas12i核酸酶Cas12i3,开发出一种健壮的Cas12i3 变体Cas-SF01,Cas-SF01 在哺乳动物细胞、小鼠和植物中表现出高效基因编辑效率。此外,还开发了Cas-SF01 的高保真版本Cas-SF01HiFi,具有改良的编辑特异性。


该Cas-SF01,这是一种Cas12i3变体,在哺乳动物细胞中表现出显著提高的基因编辑活性。与SpCas9和其他Cas12核酸酶相比,Cas-SF01显示出相当或优越的编辑性能。与天然Cas12i3相比,Cas-SF01具有扩展的PAM范围,并有效识别NTTN、非经典NATN和TTVN PAM。此外,研究人员鉴定了一种氨基酸取代D876R,它显著降低了脱靶效应,同时保持了高的靶上活性,导致了Cas-SF01HiFi(高保真Cas-SF01)的发展。最后,Cas-SF01在小鼠和植物中具有高的基因编辑活性。研究结果表明,Cas-SF01可以作为一个强大的基因编辑平台,在各种生物体的基因组编辑应用中具有高效和特异性。

改进的CRISPR/Cas12i3变体

天然Cas12i3含有1045个氨基酸(aa),比SpCas9(1368个aa)小,与先前表征的Cas12i2(1054个aa)相似。尽管在氨基酸序列中与Cas12i2只有29%的同一性,但Cas12i3具有与Cas12i2相同的结构域结构。为了评估2种Cas12i核酸酶之间的相似性,研究人员使用AlphaFold预测Cas12i3的结构,并在CRISPR RNA(crRNA)存在的情况下将其与Cas12i2结构进行比较。正如预期的那样,Cas12i3与Cas12i2具有显著的结构相似性(均方根偏差=2.4)。

改进的CAS12I3.jpg

图1。提高Cas12i3基因编辑活性


如何改进CRISPR/Cas12i3?

如图1所示

A. 基于与Cas12i2的结构相似性构建Cas12i3变体库。通过比较Cas12i3与Cas12i2的蛋白质结构,预测了其crRNA和DNA相互作用位点。然后,用精氨酸单独取代这些残基,产生具有150多个变体的库,用于鉴定改进的Cas12i3变体。

B. 改进型Cas12i3变体的筛选策略。将携带与EGFP标签和靶向FUT8基因的crRNA融合的Cas12i3变体(Cas12i3V)的质粒转染到CHO细胞中。然后,通过FACS选择EGFP+细胞,并通过深度测序确定Cas12i3变体的编辑效率。

C. Cas12i3变体的编辑效率。黑色线,野生型Cas12i3的编辑效率;红色线,Cas12i3变体的编辑效率, 是Cas12i3编辑效率的1.5倍。

D. 26个Cas12i3变体的编辑效率和改进的编辑性能。


为了筛选具有更高编辑效率的CRISPR Cas12i3变体,研究人员将每个Cas12i三变体克隆到一个一体化表达系统中,在该系统中,将Cas蛋白与EGFP标签融合,并从同一构建体中共表达靶向FUT8基因的U6启动子驱动的crRNA(图1B)。然后,将这些构建体转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中,并通过荧光激活细胞分选(FACS)选择GFP+细胞。编辑效率由目标位点的NGS测序决定(图1B)。结果显示,野生型Cas12i3表现出相对较低的编辑效率,平均约30%,超过50%的Cas12i三变体与野生型Cas12 i3表现相似,活性变化不到50%(图1C)。研究人员选择了26种Cas12i3变体,其编辑效率超过野生型Cas12i三的1.5倍,用于使用相同的测定进行进一步验证。验证分析鉴定了8种变体,即Cas12i3-S7R、N168R、D233R、T235R、D267R、T505R、S599R和D851R,它们显著提高了Cas12i3在CHO细胞中的编辑性能(图1D)。


通过氨基酸取代产生高效的Cas12i3变体Cas-SF01


Cas-SF01编辑效率2.jpg


图2. 通过两步组合策略进行Cas-SF01工程

A. 用于筛选携带突变组合的高效CRISPR Cas12i3变体(Cas12i3VC)的EGxxFP报告系统示意图。将短序列插入EGFP内部以破坏其荧光。插入序列中的靶向切割通过2个侧翼重复序列之间的单链退火(SSA)对DNA修复,从而恢复EGFP荧光。该系统还组成性地表达mCherry标记。通过测定EGFP+细胞与mCherry+细胞的比率来评估编辑效率。

B和C. 具有不同突变组合的Cas12i3对PAM相互作用区(B)和靶DNA链相互作用区的编辑效率,如由EGxxFP报告子测定的。在这两个区域中编辑率增加最高的突变组合在红框中突出显示。

D. 从筛选中鉴定的突变的进一步组合导致具有更高编辑效率的变体。编辑效率最高的变体包含5个突变(S7R/D233R/D267R/N369R/S433R),称为Cas-SF01。

E. 哺乳动物细胞TTR基因座Cas12i3和Cas-SF01吲哚活性的比较。通过Student t检验确定显著性差异。


研究人员在RuvC-II 结构域的每个残基上进行单氨基酸替换,生成Cas-SF01 的变体库,经过筛选测定发现Cas-SF01(称为Cas-SF01HiFi)中的单个变体D876R 大大降低了Cas-SF01 的错配容忍度。实验结果表明Cas-SF01HiFi 保持了Cas-SF01 近85%的靶位点编辑效率,但脱靶编辑效率却显著降低。


Cas-SF01具有较高的编辑效率和较宽的PAM范围

研究团队选择S7R、N168R、D233R 和T235R 以及N168Y 和G169W 进行组合鉴定,通过逐步测定确定了变体组合(Cas12i3-S7R/D233R/D267R/N369R/S433R)并命名为Cas-SF01。研究团队评估了Cas-SF01 编辑内源基因的性能,与野生型Cas12i3 相比,Cas-SF01产生Indel 突变的活性增加了约3倍。EgxxFP 报告系统中显示Cas-SF01 的平均编辑效率为88%,高于其他Cas核酸酶(图2)。在PCSK9、TTR和CCR5 基因的外显子上设计的40多个靶点上,Cas-SF01 的平均编辑效率约为80%,超过了hfCas12Max,AsCas12a Ultra 和SpCas9 核酸酶。在大肠杆菌中进行的PAM识别实验中,Cas-SF01 倾向于识别多种PAM,包括TTN、ATN、NATN和TTVN,这些结果说明Cas-SF01 具有较高的编辑效率和更宽的PAM 识别范围(图3)。


Cas-SF01编辑效率3.jpg


图3. Cas-SF01具有较高的编辑效率和较宽的PAM范围

A. 在EGxxFP报告子系统中,Cas-SF01表现出比野生型Cas12i3、Cas12iHiFi和hfCas12Max更高的切割活性。T1–T9基因座,EGxxFP盒插入片段中的靶位点。***p<0.001;***p<0.01;ns,不显著(Student t 检验)。

B. Cas-SF01与SpCas9、AsCas12a-Ultra和hfCas12Max在PCSK9、CCR5和TTR基因座的多个靶位点的吲哚活性比较。通过Student t检验确定显著性差异。

C. 与野生型Cas12i3相比,Cas-SF01显示出NATN PAM对靶标的识别得到改善。

D. 热图显示了Cas-SF01的PAM识别轮廓。


D876R突变提高了Cas-SF01的特异性

为了全面评估设计的Cas-SF01的编辑特异性,研究人员评估了其对间隔物和靶标之间不匹配的耐受性。研究表明,接近PAM的失配对Cas-SF0 1的活性有更大的影响,优化可以提高特异性。研究人员在T8位点使用两个设计的垫片M78和M910评估了所选变体的失配容限。Cas-SF01中的单一变体D876R(称为Cas-SF01HiFi)显著降低了Cas-SF0的失配容限。D876R对增强Cas-SF0 1的编辑特异性很重要。结果表明Cas-SF01在基因组编辑中具有高度特异性。


Cas-SF01能够在动物和植物中稳健实现基因组编辑

研究人员测试了Cas-SF01 在动物和植物中的编辑效果,结果表明Cas-SF01 可以在小鼠体内实现有效的基因编辑,此外Cas-SF01 在水稻、辣椒和大豆中编辑效率明显高于野生型Cas12i3(图4)。


Cas-SF01能够在动物和植物中稳健实现基因组编辑.jpg

图4. Cas-SF01能够在动物和植物中稳健实现基因组编辑

A. 使用LNP递送IVT-Cas mRNA和化学合成的靶crRNA的体内基因编辑示意图。

B. Cas-SF01和hfCas12Max、SpCas9在C57小鼠Ttr位点的缺失频率。Cas-SF01和hfCas12Max,n=5;SpCas9,n=3。

C. 血清TTR蛋白水平。Cas-SF01和hfCas12Max,n=5;PBS和SpCas9,n=3。

D–F. Cas-SF01在水稻(D)、辣椒(E)和大豆(F)的E0植物的不同靶位点的编辑效率。每个点代表1个目标的编辑效率。***p<0.001;*p<0.05;学生t测试。


综合而言,Cas-SF01是一个高效特异的CRISPR基因编辑工具,有机会为动植物基因编辑和基因治疗提供高效服务。


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