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细胞与组织培养技术大全(二)培养细胞的生长特点与增殖过程作者:动物细胞培养 细胞培养是生物技术研究的基础,随着克隆技术和细胞治疗技术的推广和应用,对细胞培养提出了更高的要求。 如何培养好细胞? 这里,美格君从动物细胞培养开始,和大家一起聊一下动物细胞的培养。 动物细胞培养技术大全**节 动物细胞培养基础 第二节 动物细胞、 组织培养的方法 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定 第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化 第六节 器官培养 **节 动物细胞培养基础一、 动物细胞与组织培养的基本概念 二、 动物细胞体外培养特点 三、 动物细胞培养的发展历史 四、 动物细胞的体外培养一般条件 五、 动物细胞的体外培养生物学特性 五、 动物细胞的体外培养生物学特性(二) 培养细胞的生长特点 1、细胞贴附和伸展 2、接触抑制 3、密度抑制 1. 细胞贴附和伸展 什么是细胞贴附/细胞贴壁?细胞贴附,英文是cell adhesion,也称为细胞贴壁,是指贴壁依赖性细胞在培养表面上贴附和铺展的过程。 贴附并伸展, 是多数体外培养细胞的基本生长特点。 细胞贴壁底物:包括其他细胞、 胶原、 玻璃或塑料等。 一类特殊的促细胞附着的物质(如基膜素、 纤维连接素、 Ⅲ型胶原、 血清扩展因子等) 可能参加细胞的贴附过程。 培养细胞在未贴附于底物之前一般均似球体样; 当与底物贴附后, 细胞将逐渐伸展而形成一定的形态。 ✿ 细胞贴壁与什么因素有关?细胞能否在培养表面上贴附,主要有下列因素: ①细胞本身的特性,即细胞因素; ②生物因素,如促附着因子; ③细胞与培养表面接触概率, ④细胞与培养表面的相容性,这又与表面的化学物理性质有关。 ⑤细胞贴壁速率也与培养表面的化学物理性质有关,特别是培养表面上的电荀密度影响较大。血清中的冷析蛋白和纤维粘连蛋白可在培养表面与细胞间架桥,有利于加快细胞贴附速率。细胞在培养表面上的铺展除了与以上因素有关外,还与表面情况特别是光滑度有关。 ⑥机械、 物理因素,例如低温或培养液的流动过快; 离子的作用等。 ✿ 避免细胞贴壁可采取的措施:① 包被; ② 减少接种时细胞悬液的量; ③ 培养液中离子成分及浓度 ④ 培养液的温度 ✿ 细胞贴附的一些基本概念 ● 细胞粘附分子:是众多介导细胞间或细胞与细胞之间相互接触和结合分子的统称。 ● 细胞外基质:是由动物细胞合并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子。 二者大多数均为糖蛋白,因此具有较强的亲水性——因此能不能贴壁不仅仅关乎细胞是否有这种能力,也与有无合适的底物(培养瓶)有关。 大多数的哺乳动物细胞在体内和体外均附着于一定的底物而生长,在体外时这些底物可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。 ● 贴壁的过程:细胞首先分泌细胞外基质,这种细胞外基质黏附在支持物的表面(培养瓶,培养皿的底面)。然后,细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。 在了解不同细胞外基质对细胞粘附的效果是否一致之前,我们首先要来了解细胞是如何进行贴壁的! ✿ 细胞贴壁的过程(见图1):① 促细胞附着因子吸附于底物上 ② 悬浮的圆形细胞与底物附着 ③ 细胞将伸展成其原来的形态 细胞首先分泌细胞外基质,这种细胞外基质粘附在支持物的表面(培养瓶、培养皿的底面等),之后,细胞通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合。 图1. 细胞贴壁原理图 (美格生物) 通过上面我们了解了细胞贴壁,知道细胞会通过其表面表达的黏附因子与这些细胞外基质结合,一起参与细胞的贴附过程。这些促细胞附着因子均为蛋白质(如:粘连蛋白、纤维连接蛋白等等),通常存在于培养液中。这些带阳电荷的促贴附因子先吸附于底物上,细胞再与已吸附的有促贴附物质的底物附着,之后细胞将伸展成其原来的形态。所以细胞贴壁与否,不仅与细胞本身分泌细胞外基质的能力有关,而且与细胞本身表达的黏附分子的数量也有关,还和底物的表面结构有关。 ✿ 哪些物质可以促使细胞贴壁?① 胶原蛋白 胶原蛋白是支持细胞和组织生长的重要胞外基质蛋白,其形成的胞外环境有利于多种细胞的粘附、生长、迁移和分化。 ② 纤粘连蛋白(Fibronectin,FN) 纤粘连蛋白是一种位于细胞表面和血浆中的大分子蛋白质,是一种主要的细胞黏附分子,在细胞纤维基质中发挥结构和黏附性作用。 ③ 层粘连蛋白(Laminin) 层粘连蛋白是细胞外基质的重要组成,存在于所有上皮细胞和内皮细胞的基底侧,同时也是某些细胞与细胞间交互作用的中间媒介。层粘连蛋白有细胞及组织特异性,对于调节细胞功能具有重要作用,如:协助粘附、促进生长、引导迁移、调控分化、维持表型、防止细胞凋亡等。 ④ 玻璃粘连蛋白(Vitronectin) 玻璃粘连蛋白属于小分子蛋白,借由Vitronectin 受体让细胞贴附于细胞基质中,主要促进细胞迁移,增加细胞贴附性、细胞分裂、细胞生长分化等,并协助细胞间的讯号传递。 2. 接触抑制(Contact inhibition) 细胞从接种到长满底物表面后, 由于细胞繁殖数量增多相互接触后, 不再增加。 一般的正常细胞并不互相重叠于其上面而生长; 但是, 转化细胞或癌瘤细胞则接触抑制下降, 他们互相之间可在上面或下面经过而重叠生长。 图4. 细胞接触抑制的影响 3、 密度依赖性(Density inhibition) 3T3细胞系, 在细胞稀少状态下培养时, 其生长迅速; 但一旦细胞生长汇合成一片时(每6cm培养皿约10 6 个细胞) , 其分裂增殖停止。 其确切的细胞密度常与培养液中的血清浓度有关。 上述这种生长特性即为密度依赖性调节(或密度抑制) 。 转化细胞或恶性肿瘤细胞则与正常细胞不同, 他们的密度依赖性调节常常降低, 因而可以生长至较高的终末细胞密度。 (三) 体外培养细胞的生长与增殖过程1、 单个细胞的生长过程: 与体内细胞周期相似, 经历G1、 S、 G2、 M期(见图5)。 细胞的分裂周期长 细胞分裂时间为12~48h, 细胞的分裂周期=间期+分裂期间期(G1+S+G2)分裂期(M) 典型的人的体细胞的细胞周期时间为24小时 G1期约11小时 S期约8小时 G2期4小时 M期1小小时 G0期,也称静止期,细胞暂时离开细胞周期。细胞转化为G0期多发生在G1期。G0期细胞一旦得到信号会返回细胞周期。 图5. 细胞周期 各类细胞分裂周期时间表细胞类别 细胞分裂周期时间/h G1 S G2 M 合计 人胚肺成纤维细胞(WI-38) 8 8.0 4.0 0.8 20.8 人T细胞 10.5 7.6 3.2 0.8 21.1 急性淋巴性白血病细胞 >1~10d 20 2~3 1.0 >2~10d 小鼠腹水癌细胞 5.7 8.5 3.8 1 19 中国仓鼠卵巢细胞(CHO) 4.7 4.1 2.8 0.8 12.4 中国仓鼠成纤维细胞 2.7 5.8 2.1 0.4 11 小鼠肿瘤细胞 - 12 6 0.5 18.5 小鼠成纤维细胞 9.1 9.9 2.3 0.7 22.0 2、 细胞系的生长过程: 体外培养细胞寿命的过程可分为三个阶段 (1) 原代培养期 (2) 传代期 (3) 衰退期 (1)原代培养期(初代培养) 为新鲜组织自体内取出接种培养至**次传代的阶段,一般持续1~4周。 特点: 原代细胞培养通常为异质性, 细胞独立生存性差, 多呈二倍体核型, 更能代表其来源组织的细胞类型及组织特异性, 是检测药物的很好实验工具。 (2)传代期 当细胞持续生长增殖一段时间, 达到一定的细胞密度后, 就应当将细胞分离成两部分(或更多) 至新的培养器皿中, 并补充更新培养液, 此即为传代。 特点:在细胞整个生命期中此期的持续时间最长,一般情况下, 可传代10~50代。 细胞增殖旺盛, 并能维持二倍体核型, 被称为二倍体核型。 有限细胞系和**细胞系 动物细胞离体培养起始物, 我们称之为原代培养(primary culture) 。 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。 有限细胞系: 细胞自动物体内取出后, 在培养中仅持续生长有限时间, 然后将自行停止生长。 即使提供生长所需的营养物质(包括血清) , 最终也会死亡。 这种 寿命仅能维持一段时间的细胞系, 称为有限细胞系。 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖, 当超过有限世代后, 它们可能有两种情况, 一是衰老死亡, 二是发育成**细胞系或称连续细胞系。 有限细胞系转换成**细胞系的过度期称为转换期(crisis), 其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。 **细胞系有如下特征: 细胞形态变化, 如细胞变小, 黏附性减少, 具有较高的核质比; 生长速率增加, 倍增时间缩短; 对血清的依赖性减小; 贴壁依赖性降低; 细胞异倍体和非整倍体增加, 细胞接种到体内后, 生癌率上升。 结果: 细胞群体中具有迅速增殖能力的细胞将渐占优势,而不增殖的或增殖缓慢的细胞将被减弱。 图6. 细胞培养生长曲线 magigen.com (3)衰退期, 此期细胞虽仍存活, 但增殖基本停止, 细胞形态轮廓增强, 进而细胞发生衰退、死亡。 细胞在第二期末或第三期初阶段, 通过所谓“危机期” (crisis), 获得不死性而具有持久或无限增殖的能力。 失去接触抑制。 3、 每代细胞的生长过程 在细胞的生长过程中, 繁殖到一定密度后, 将之分开而移至新的培养皿中称为接种。 细胞” 一代” : 仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间。 每代细胞的生长阶段 潜伏期 指数生长期 停止期 培养细胞传代的生存期: 1)潜伏期(latent phase) 2)指数生长期(logarithmic growth phase)又称对数期--试验用 3)平台期又称生长停滞期(stagnate phase)。 -- --传代 1) 潜伏期 潜伏期特点: 潜伏期长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关 (1) 细胞贴附后进入潜伏期, 细胞无增殖。少见分裂相,细胞有运动活动。 (2) 初代培养 细胞潜伏期约为24~96小时或更长, 连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期约6~24小时 (3) 细胞接种密度大,则潜伏期短 2) 指数生长期 细胞增殖旺盛, 成倍增长, 活力**, 适用于进行实验研究。 持续3~5天。 细胞生长增殖状况可以细胞群体倍增时间及细胞分裂指数等来判断。 在此阶段, 若细胞处于理想的培养条件, 将不断生长繁殖, 细胞数量日渐增加。 细胞将接触而连成一片, 渐次铺满培养器皿底物, 提供细胞生长的区域逐渐减少甚至消失。 因接触抑制而细胞运动停止、 密度抑制而细胞终止分裂。 细胞不再繁殖而进入平台期。 3) 平台期 又称生长停滞期。 此期细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满, 细胞量和密度达到饱和, 细胞停细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖,细胞数量持平。 特点细胞虽已停止生长, 但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。 若及时分离培养、 进行传代, 将细胞分开接种至新的培养器皿,并补充以新鲜培养液, 细胞将于培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。 否则细胞因中毒而发生死亡。 注意: 传代过晚将影响下一代细胞的生长至少要再传1~2代,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上要特别注意。 扩展阅读
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