细胞与组织培养技术大全(三)动物细胞、 组织培养的方法

细胞培养是生物技术研究的基础，随着克隆技术和细胞治疗技术的推广和应用，对细胞培养提出了更高的要求。

如何培养好细胞？

这里，美格君从动物细胞培养开始，和大家一起聊一下动物细胞的培养。

动物细胞培养技术大全

**节 动物细胞培养基础

第二节 动物细胞、 组织培养的方法

第三节 培养细胞的检测和特性鉴定

第四节 动物细胞体外培养举例

第五节 细胞同步化

第六节 器官培养

第二节 动物细胞、 组织培养的方法

一、 体外培养的一般过程

二、 动物细胞培养的基本方法

三、 动物细胞大规模培养技术

四、 动物细胞体外培养举例

五、 动物细胞体外培养现状与展望

一、 体外培养的一般过程

(一)、动物取材过程

1、引颈杀死

2、浸入酒精消毒

3、环行剪开皮肤

4、翻转剥皮

5、开腹

6、剪取需要的组织

(二)、动物细胞培养一般过程：

组织获得→ 组织消化→ 接种→培养→传代及细胞冻存复苏等

1、取得动物胚胎或幼龄动物的组织、 器官，从组织切片中取下小片样品；

2、动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质， 将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。用胰蛋白酶分解这些弹性纤维，获得单个细胞；

3、加培养液，生成细胞悬液，

4、在二氧化碳培养箱中开始原代培养，生成1代细胞

5、将原代细胞分装到多个扁形瓶中进行继代培养，然后反复传代培养，到50代细胞，到无限传代

图.   人肺组织培养过程图解

(三)、 原代培养与传代培养技术

1、 原代培养分为两种：

(1)   组织块培养法

(2)   组织消化培养（单层培养法） ： 适用于细胞间质较少的软组织， 如胚胎、 羊膜、 上皮、 肝肾及传代细胞等。

✿ 一般而言幼体组织比老龄组织， 分化低的比分化高，肿瘤组织比正常组织易于培养。

（1）组织块培养方法

组织块培养基本步骤：

a. 无菌取出目的组织, 修剪冲洗;

b. 用利刀无菌切割成1mm³左右的小块；

c. 以Hanks液漂洗干净, 低速离心，弃上清移入培养瓶， 分布组织小块，间距5mm, 加入适当培养基浸润;

d. 培养瓶翻转180度， 静止1 -2h，37℃, 使其贴壁;

e. 培养瓶翻回， 置于37℃培养;

f. 原代细胞生长.

(2) 组织消化培养方法：

取材分离和组织消化

a. 无菌取出目的组织

b. 用利刀无菌切割成细块

c. 加入30-50倍体积0.25%浓度胰蛋白酶溶液, 胰蛋白酶液消化，相关酶类包括： 胰蛋白酶、 胶原酶、 链霉蛋白酶、 黏蛋白酶、 蜗牛酶等， 需根据酶及组织成分的特点选择使用;

d. 在37℃消化30-60min， 每5-10min摇动一次；

e. 用Hanks液漂洗两次， 低速离心弃上清，过滤或离心除去未消化的渣子；

f. 吸管吹打分散细胞

g. 移入培养瓶薄层培养

(3) 原代培养与检查

a. 接种、 培养

b. 常规检查，检查细胞形态及活力、 检查营养液pH及污染

2、 传代培养技术

• 传代： 当原代培养成功后， 细胞分裂增殖成片时，需要对其分离重新培养， 这一操作过程成为传代。

• **次传代时间： 有80-90%或刚刚全部汇合的细胞是传代的理想时期。 过早产量不足， 过晚细胞状态不佳。

(1) 贴壁生长细胞传代

✿ 传代基本步骤：

a. 吸出培养瓶内旧培养液

b. 加入胰蛋白酶和EDTA混和液，以能覆盖整个瓶底为准

c. 吸出消化液， 加入培养液终止消化

d. 吸管轻轻吹打使细胞分散成悬液， 计数

e. 重新接种于新的培养瓶内

f. 培养

✿ 消化法传代培养过程

a. 加消化液得到分散的细胞

b. 吸除消化液

c. 加培养液终止消化

d. 吹打分散成悬浮液

e. 转移接种多个培养瓶生长

(2) 悬浮生长细胞传代

✿ 离心法传代

离心法传代： 离心（1000 转 / 分 -800g） 去上清， 沉淀物加新培养液后再混匀传代。

✿ 直接传代法

直接传代法： 悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除 1/2 - 2/3， 然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。

（四） 细胞纯化

1、自然纯化

自然纯化是利用某一细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，最后留下有生长优势的细胞，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。

2、人工纯化

(1)酶消化法:

1)先用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合漂洗培养细胞，然后再换新的混合液继续消化，之后，在倒置的显微镜下观察，并不时摇动培养瓶，等到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。

2)把消化液吸入离心管中，离心去上清，然后移入另一培养瓶中，加培养液，置温箱中培养，对于原培养瓶中的残留细胞，不添加新的培养液，而是让这些细胞在没有新鲜培养液的情况下继续培养。经过几次反复处理，可把成纤维细胞去除干净。

(2)机械刮除法

1)标记, 镜下观察，在培养皿背面圈下上皮细胞生长部位

2)刮除, 弃培养基，把无菌刀深入瓶中，肉眼或显微镜下刮除无标记空间

3)冲洗, 用hank's液冲洗1或2次，洗出被挂掉的细胞

4)培养, 然后注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞存留，可再刮除

(3)反复贴壁法: 操作方法与贴壁细胞传代基本相同

(4) 克隆法

(5) 流式细胞仪技术

(6) 其他纯化方法

(五) 细胞的冻存复苏

细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。

1、 冻存意义：

1） 长期保存细胞；

2） 防止细胞老化；

3） 减少人力、 经费， 减少污染。

2、 冻存和复苏的原则： 慢冻快融

 当细胞冷到零度以下， 可以产生以下变化： 细胞器脱水， 细胞中可溶性物质浓度升高， 并在细胞内形成冰晶。

 在细胞冻存时要尽可能均匀地减少细胞内水分， 减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。

 如果缓慢冷冻， 可使细胞逐步脱水， 细胞内不致产生大的冰晶；相反． 结晶就大， 大结晶会造成细胞膜、 细胞器的损伤和破裂。

 复苏过程应快融， 目的是防止小冰晶形成大冰晶， 即冰晶的重结晶。

3、 保存细胞三要素： 营养、 保护剂和低温

低温保护剂的应用

● 在细胞冻存时加入保护剂， 能大大提高冻存效果。

● 常用的低温保护剂是甘油或DMSO， 渗透性保护剂， 可迅速透入细胞， 提高胞膜对水的通透性， 降低冰点， 延缓冻结过程， 能使细胞内水分在冻结前透出细胞外， 在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶， 从而减少冰晶对细胞的损伤。

● 保护剂的浓度在5~15%之间， 常用10%。

4、 慢冻程序

● 标准程序：

① 当温度在-25 ℃以上时， 1～2 ℃/min

② 当温度达-25 ℃以下时， 5～10 ℃/min

③ 当温度达-100℃时， 可迅速放入液氮中

● 简易程序：

将冷冻管（管口要朝上） 放入纱布袋内， 纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口， 按每分钟温度下降1～2 ℃的速度， 在40分钟内降至液氮表面， 停30分钟后， 直接投人液氮中。

✿ 细胞冻存方法

1. 预先配制冻存液： 含20%血清培养基 9份DMSO 1份

2. 取对数生长期细胞， 经胰酶消化后， 加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1× 10 6 ～ 5 ×10 6 细胞/ml)

3. 分装： 每瓶1ml， 密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。

4. 冻存

(1) 传统方法：

冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ 80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽长期储存。 -20℃不可超过1小时， 以防止冰晶过大， 造成细胞大量死亡， 亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中， 惟存活率稍微降低一些。

(2) 程序降温：

利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至(-80℃以下)-120℃， 再放在液氮长期储存。

适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

● 细胞冻存步骤:

(1)取生长状态好的细胞消化, 制成细胞悬液

(2)离心洗涤

(3)加含10%DMSO冻存液

(4)加入安瓶

(5)熔封

(6)70 ℃放置2-3h

(7)移入液氮罐中

(8)记录

细胞复苏步骤:

(9)取出安瓶立即放入37℃水中

● 冻存要点：

1） 慢冻

2） 取对数生长期细胞进行冻存， 无微生物污染；

3） 细胞浓度： 达到106 /毫升

4） 合适的冷冻保护剂： DMSO,常用10%。

5） 使用高浓度血清

5、 细胞复苏方法

用快速融化的手段， 以保证细胞外结晶在很短的时间内融化， 避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害 。

细胞复苏 程序：

（l） 从液氮中取出冷冻管， 迅速投入37～38 ℃水浴中， 使其融化（1分钟左右） 。

（2） 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。

（3） 低速离心10分钟。

（4） 去上清， 加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

二、 动物细胞培养的基本方法

1. 悬滴培养法

2. 旋转管培养法

3. 灌注小室培养法

4. 培养瓶培养方法

5. 培养板培养法

6. 克隆培养法

1、 悬滴培养法

✿ 悬滴培养法： 又称植块悬滴培养法， 1907年， 哈里森首创。 即将组织或器官植块接种在一张盖玻片上， 滴上一滴培养液， 然后翻转盖玻片使植块及营养液悬挂于盖玻片下， 再置于一凹形载玻片上， 最后用熔蜡密封后放于培养箱中培养。

● 优点：

1） 容易换片。

2） 培养物在培养过程中， 不需移动位置， 有利于组织分化。

2、 旋转管培养法

    盖尔（Gey， 1933年） 、 刘易斯（Lewis， 1934年）建立该方法。

● 特点： 是培养中组织块或细胞交替地与培养液和空气直接接触。 包括旋转管、 旋转鼓、 支架等。

● 缺点： 不易在显微镜下观察。

3、 灌流小室细胞培养法

   在盖玻片悬滴法基础上发展而来，可用于连续观察细胞动态变化，研究各种因素影响作用及活细胞反应。 1912年由Burrows首创。

4、培养瓶培养方法

   培养瓶培养方法： 指将培养对象直接接种于培养瓶内培养。

  1923年， 卡雷尔（Carrel） 设计了卡氏瓶。 Earle设计了T-培养瓶。 采用的材料对细胞无毒， 透明。

✿ 盖玻片+培养瓶培养法： 先以盖玻片为生长表面，将拟培养细胞或组织接种于盖玻片上， 然后放进培养瓶中进行培养。

● 优点：

1） 可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物的影响

2） 可以方便显微观察、 染色等操作， 以及**保存；

3） 增加了培养瓶培养面积。

5、 培养板培养法

  培养板培养法又称微量培养法。一般是一次性使用。

6、 克隆培养法

克隆培养法就是将细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之重新繁殖成一个新的细胞群体的培养技术。

克隆培养法过程:

a. 制细胞悬液

b. 连续稀释获得单细胞

c. 单细胞接种

d. 培养

细胞株 : 由细胞系进一步克隆化， 而获得的由单一细胞形成的细胞群体。

三、动物细胞大规模培养技术

动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养和悬浮培养法基础上， 再融合固定化细胞、 流式细胞术、 填充床、 生物反应器、 人工灌流技术等发展起来的。

（一） 培养方法

1、转瓶培养

2、反应器贴壁培养

3、悬浮培养技术

4、微载体培养技术

5、多孔载体培养技术

6、微囊化培养技术

7、中空纤维法

其中，微载体培养、多孔载体培养、微囊化培养技术是固定化培养。

1、 反应器贴壁培养

此种培养方式中， 细胞贴附于固定的表面生长， 不因为搅拌而跟随培养液一起流动， 因此比较容易更换培养液， 不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度， 能有效地获得一种产品； 但扩大规模较难， 不能直接监控细胞的生长情况， 故多用于 制备用量较小、 价值高的生物药品。

2、 悬浮培养技术

适于少数悬浮生长型细胞

a. 悬浮培养的步骤：

b. 剪切成细块

c. 酶液消化、吹打分散成细胞悬浮液

d. 酶液消化成分散细胞

f. 加培养液终止消化   吹打分散成细胞悬浮

g. 逐级稀释

3、 微载体培养技术

  1967年， Van Wezel开发了微载体系统培养贴壁细胞， 以直径60-250um微珠作为微载体。

✿ 微载体培养原理： 其原理是将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中， 作为载体， 使细胞在微载体表面附着生长， 同时通过持续搅动使微载体始终保

持悬浮状态。

✿ 理想的细胞支持物特征： 生物相容性； 无毒害； 好的传质特征； 机械稳定性好； 比表面大， 适于细胞生长； 颗粒均一； 能高压灭菌； 可重复利用， 易清洗； 接种方便； 能固定大部分细胞， 能保护细胞，易使细胞、 载体和培养基分离； 适合贴壁细胞和悬浮细胞培养。

✿ 微载体系统培养细胞具体步骤

a. 选择合适的微载体类型

b. 浸泡水化及消毒

c. 接种

d. 培养观察和细胞计数

e. 消化

f. 分离细胞

g. 传代培养

✿ 常用商品化微载体有：

Cytodex1 、2、 3， Cytopore和Cytoline。

交联葡萄糖

DEAE-纤维素

蛋白质： 变性胶原

高分子材料： 硅胶、 聚丙烯酰胺、 聚苯乙烯

无机玻璃基质

5.   多孔载体培养

● 优点： 易固定化、 比表面大、 细胞在载体内生长， 免受机械损伤； 可以提高通气量， 强化传质。 适用于贴壁细胞培养、 悬浮细胞固定化连续灌流培养和大规模高密度培养系统。

● 多孔载体材料要求： 生物相容性、 机械稳定性、 热稳定性

6、 微囊化培养技术

   用人造的半透膜制成的多孔微球体， 借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊内。 适用于单克隆抗体、 干扰素等的制备。微囊直径控制在200-400μm为宜。

✿ 制备中应注意：

● 温和、 快速、 不损伤细胞， 尽量在液体和生理条件下操作；

● 所用试剂和膜材料对细胞无毒害；

● 膜的孔径可控制， 必须使营养物和代谢物自由通过；

● 膜应有足够机械强度抵抗培养中搅拌。

6、 中空纤维法

   Richard Kncazek 1972年发明。 最初使用醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成海绵状多孔结构。可以模拟细胞体内三维状态。

  目前，用于中空纤维法的材料有： 硅胶、 聚丙烯等。

● 中空纤维法优点是：占地空间少；细胞产量高， 细胞密度可达1⁰9数量级；生产成本低， 且细胞培养维持时间长， 适用于长期分泌的细胞

动物细胞培养的产物的应用 magigen.com

（二） 动物细胞生物反应器培养

1、 动物细胞生物反应器的特点分析

动物细胞生物反应器反应器主要结构形式：

● 搅拌式

● 气升式

● 固定床式

✿ 技术要求： 能提供均匀温和的混合状态， 剪切力小，传质效果好； 反应器空间利用率高， 选用合适载体系统和材料； 能保证严格无菌； 能控温、 酸碱、 溶氧和CO₂浓度； 能方便快捷实现培养液连续添加，样品采集和观察。

2、 动物细胞生物反应器应用概况

   动物细胞培养常用的生物反应器：

● 柱状中空纤维反应器

● 板框式中空纤维反应器

● 中心灌流式反应器

● 灌流微载体生物反应器

● 旋转壁式反应器

（三） 动物细胞大规模培养操作方式

1 .分批式操作

● 优点： 操作简单， 培养周期短， 污染和细胞突变的风险小。

● 缺点： 费用高， 每一次收液后， 都要进行一系列新的接种放大的准备工作， 此期间生产停工。 而且收液率低.

2. 流加式操作

3. 半连续式操作

● 优点： 生产效率高， 可反复长期培养， 反复收获产品。

4. 连续式操作

● 优点： 反应器的培养状态可以达到恒定， 细胞在稳定的状态下生长。

● 缺点： 开放式操作， 容易造成污染。 细胞容易发生变异， 且对设备等要求高。

5. 灌流式操作

● 优点： 培养状态恒定， 细胞在稳定的状态下生长。 产量高等.

(四) 、 动物细胞生物反应器大规模培养的产品

1、 应用产品

● 病毒疫苗： 乙肝、 脊椎灰质炎和狂犬疫苗等

● 非抗体免疫调节剂： 干扰素、 白细胞介质、 B细胞生长因子、巨噬细胞激活因子、 T细胞替代因子等

● 多态生长因子： 神经、 成纤维、 表皮、 血清生长因子等

● 酶类： 组织血纤维酶原激活剂

● 激素： 红细胞、 促黄体生成素、 促滤胞素

● 肿瘤特异性抗原： 癌胚抗原

● 单克隆抗体

● 病毒杀虫剂： 杆状病毒

2、 动物细胞生物反应器大规模培养的关键技术

● 细胞培养环境 ： 氨离子、 乳酸、 二氧化碳、 甲基乙二醛、 渗透压、 载体…

● 细胞死亡与凋亡 ： 基因工程的调控…

● 培养基与细胞系： 无血清培养基的研发， 基因工程的应用…

● 过程监控： 在线氧吸收速率、 葡萄糖分析， 亲和层析与在线取样系统偶联等

扩展阅读

‍细胞与组织培养技术大全(一)动物细胞培养基础

细胞与组织培养技术大全(二)培养细胞的生长特点与增殖过程

细胞与组织培养技术大全(三)动物细胞、 组织培养的方法‍

细胞与组织培养技术大全(四)培养细胞的检测和特性鉴定‍

细胞与组织培养技术大全(五)动物细胞体外培养细胞同步化与器官培养

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