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细胞与组织培养技术大全(四)培养细胞的检测和特性鉴定作者：动物细胞培养 细胞培养是生物技术研究的基础，随着克隆技术和细胞治疗技术的推广和应用，对细胞培养提出了更高的要求。 如何培养好细胞？ 这里，美格君从动物细胞培养开始，和大家一起聊一下动物细胞的培养。 动物细胞培养技术大全**节 动物细胞培养基础 第二节 动物细胞、 组织培养的方法 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定 第四节 动物细胞体外培养举例 第五节 细胞同步化 第六节 器官培养 第三节 培养细胞的检测和特性鉴定一、 培养细胞的常规检查细胞接种或传代以后， 在生存期间， 实验者每天或至多间隔1-2天， 要对细胞做常规性检查. 观察的结果是： 污染与否， 细胞生长和pH等情况，随时掌握细胞动态变化， 以便做换液或传代处理，如发现异常情况应及时采取措施。 1、 细胞形态 生长状态良好的细胞， 在一般显微镜下观察时透明度大， 轮廓不清， 只有用相差显微镜， 才能看清细胞的细微结构。 细胞机能不良时， 轮廓增强， 胞质中常出现空泡、 脂滴和其他颗粒状物， 细胞之间空隙加大， 细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点， 如上皮细胞变成类纤维细胞等。 只有状态良好的细胞才宜利用进行实验。 在很多情况下， 细胞虽机能状态不良， 但仍可生长， 如支原体轻度污染时即如此。 因此生长与否尚不能作为判定细胞好坏的**标准， 必须做全面分析。 2、 细胞生长情况 很多时候， 开始从细胞组织**“长” 出的是游走细胞， 它们单独活动， 形态不规则， 用缩时逐格显微电泳法可揭示出它们极活跃的变形、 游走和吞噬活动。 在游走细胞之后， 接着出现的是成纤维细胞或上皮细胞。 说细胞“生长” 不如说移动更为恰当， 因这时尚很少见细胞分裂， 仅有细胞运动而已。只有当细胞分裂出现后， 细胞数量逐渐增多， 形成较大的生长晕或连接成片时， 才真正进入了生长状态。 3、 细胞培养液 在正常情况下， 培养液呈桃红色。 用一般温箱培养时， 随细胞生长时间的延长， CO2积累增多， 在超越缓冲范围后， 营养液酸化变黄， 如不及时调节PH， 对细胞会发生不利影响，严重时细胞脱落死亡。 培养液中加Hepes或用５ ％CO2温箱培养可使PH维持稳定。 用磷酸盐缓冲系统时， 可因瓶口漏气， CO2溢出， 也可能由于培养瓶和瓶塞洗刷不洁残留碱性物， 使之变碱发红。 更换营养液时间， 可依营养物的消耗而定， 细胞生长旺盛时２ －３ 天换一次， 生长缓慢时， ３ －４天亦可。 4、 微生物污染 在长时间多量培养工作中， 即使用品消毒操作严密，亦难避免偶尔发生污染。 微生物污染的途径 ● 空气、 器材、 操作、 血清、 组织样品 污染对培养细胞的影响及检测 体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力， 而且培养基中加入的抗生素的抗污染能力也是有限的，因而培养细胞一旦发生污染多数将无法挽救 1） 细菌的污染及检测多数培养细胞在遭到细菌的污染后， 培养液短期内颜色变黄， 产生大量酸性物质， 出现明显混浊现象， 可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。 培养检测， 可以取少量培养液涂布在无菌琼脂培养基上， 过夜查看。防止， 通常在严格的实验操作之外， 培养基中加入青霉素、 链霉素能够有效的防止细菌污染。
图1. 球菌污染与杆菌污染案例 magigen.com 2） 真菌的污染检测真菌的污染物通常是培养基表面漂浮的白色及黄色、黑色的小点。 在显微镜下可见丝状细胞的交叉。 防止， 酒精棉球擦洗清除瓶口污染， 必要时加入抗真菌剂。
图2. 霉菌与酵母菌污染 3） 支原体的污染和防止支原体是一种介于细菌和病毒之间、 能独立生活的微生物， 无细胞壁， 直径最小可以达到0.2 μm， 在0.22μm的滤膜过滤仍然有1%左右的支原体可以通过。 支原体 污染后的培养细胞中没有明显可见的特征， 所以很难发现。 检测设备和方法 ● 相差显微镜检测： 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上， 24h后取出， 用相差油镜观察， 支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间； ● 荧光染色法： 用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst33258， 可使支原体内含有的DNA着色， 染色后用荧光显微镜观察。 具体方法如下： 首先将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片， 用不含酚红的Hanks液漂洗一下，用1： 3醋酸甲醇固定10min， 然后用生理盐水漂洗， 置于用生理盐水配置浓度为50μg/ml的Hoechst33258中染色 10min。 染色后用蒸馏水洗1-2min， 向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴， 然后置荧光显微镜下观察。 镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 ● 电镜检查： 用扫描电镜方法简便快速， 也可以利用透射电镜。 ● 镜下观察支原体膜为三层结构， 其中央有电子密度大的密度颗粒群或丝状的中心束。 支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。 横断面与细胞微绒毛相似， 但微绒毛电子密度比支原体小， 且中央无颗粒群或中央束。 支原体代谢需固醇类物质， 部分种类需要精氨酸、 Ο2或葡萄糖， 每一种支原体都有自身特点。 ● DNA分子杂交检查或支原体培养等方法： 检出率高， 但方法较复杂。
图3. 支原体污染的Vero细胞的前后对比 4） 病毒的污染及检测滤器对某些病毒的阻挡作用，许多滤器能够有效地阻挡较大的病毒颗粒，尤其是那些孔径小于病毒大小的滤器。例如，0.22微米的滤器常用于液体的无菌过滤，虽然不是所有的病毒都能被这种尺寸的滤器完全阻挡（因为某些病毒可能非常小），但对于大多数病毒来说，这种滤器是有一定效果的。 病毒本身不能在细胞外复制，它们必须进入宿主细胞才能进行复制。因此，病毒污染的问题更多在于它们如何进入细胞培养环境并在那里复制。 病毒具有特定的宿主范围和感染能力，这意味着并非所有细胞都会被所有类型的病毒感染。但是一旦合适的病毒进入细胞培养中，它可能会迅速增殖并导致污染问题。 ● 检测方式：抗体检测（如ELISA）和PCR检测是常用的病毒检测方法。此外，还有其他技术可用于检测病毒的存在，比如病毒培养、免疫荧光等。 细胞交叉污染及检测 细胞交叉污染的发生率：细胞交叉污染是指不同类型的细胞混合在一起的情况。尽管通过良好的实验室操作规程可以减少这类事件的发生，但交叉污染仍然是一种常见的问题。 ● 检测方法：常见的细胞形态观察确实可以帮助识别不同类型的细胞，但这种方法可能不足以区分相似的细胞类型或发现少量的污染物。更可靠的检测方法包括分子生物学技术，如短串联重复序列（STR）分析，它可以提供细胞系的身份验证，并帮助检测可能的交叉污染。 微生物污染防治要注意哪些？✿ 微生物污染的预防 ● 培养前的预防 ● 培养操作时的预防 ✿ 美格君提醒其他注意事项 ● 必要的细胞备份 ● 对新引进或构建的细胞株应加强观察， 并做必要的支原体和病毒的检查。 ● 定期消毒培养箱。 ● 多数污染无法挽救，受污染后要丢弃； ● 细胞培养的关键在于无菌操作 ● 利用抗生素，加温处理，动物体内接种等处理污染。 ● 防止细胞交叉污染。 二、 培养细胞的生物学鉴定1、 细胞形态观察 内容： 细胞形态、 核质比例、 染色质、 核仁大小及多少、 微丝微管排列状态等 方法： 倒置相差显微镜、 电镜 2、 细胞生长情况 ✿ 细胞生长曲线测定 1）细胞计数法 ● 使用显微镜和细胞计数板进行的手工细胞计数。 ● Counter计数仪 这种方法通常使用的是血球计数板（hemocytometer），这是一种专门设计用于细胞计数的设备，它具有刻度网格和特定尺寸的小室，可以通过显微镜观察并计数细胞数量。 基本操作： ① 准备计数板： 使用酒精清洗计数板，并确保干净无污染。 放置一个盖玻片在计数板上，，微微移向一侧， 以便滴加细胞悬液.。 ② 制备细胞悬液： 取一吸管伸入培养瓶， 轻轻吹打细胞悬液，确保细胞均匀分布。 ③ 添加细胞悬液： 从盖玻片的一边加入少量细胞悬液，让其自动扩散至计数板和盖玻片之间的空隙。 ✿ 注意： 勿使液体漫过盖片或出现气泡。 ④ 镜下观察和计数： 使用显微镜观察计数板上的细胞，并计数指定区域内的细胞数量。 根据规则，只计算位于网格四角大格内的细胞，对于压线的细胞，只计算左侧和上方的细胞，忽略右侧和下方的细胞。 这种方法虽然相对简单且成本较低，但需要一定的经验和技巧来准确计数。相比之下，使用自动细胞计数仪（Counter计数仪）可以更快捷地获得结果，而且通常更精确可靠。 步骤 a. 取生长良好接近汇合的细胞， 用胰酶消化， 用新培养基制成细胞悬液后计数。 如是非贴壁细胞， 则离心弃旧培养基后， 换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。 b. 根据细胞计数结果按每个小方瓶5× 104 ／ mL作传代培养接种细胞， 共接种21瓶细胞。 c. 24 h后开始计数细胞， 以后每隔24 h计数一次， 每次取3瓶细胞， 分别进行计数。 计算平均值。 连续计数7 d。 d. 根据细胞计数结果， 以单位细胞数(细胞数／ mL)为纵坐标， 以时间为横坐标绘制生长曲线。 2）四唑盐（MTT） 比色法 四唑盐（MTT） 商品名为噻唑蓝。 ✿ 四唑盐比色法的原理： 活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)， 并沉淀在细胞中， 而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO） 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物， 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 再用酶标仪测定OD值。 ✿ 四唑盐MTT比色法的优点： MTT比色法简单快速、 准确， 广泛应用于新药筛选、 细胞毒牲试验、 肿瘤放射敏感性实验等。 MTT比色法操作步骤 （1） 单细胞悬液接种于96孔培养板； 10 3 -10 4 细胞/孔， 每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升） ， 37℃、 5％CO 2 培养箱中培养一段时间（根据实验 目的决定培养时间） （2） 加入2毫克／ 毫升的MTT液（50微升／ 孔） ； 继续培养3小时。 （3） 吸出孔内培养液后， 加入DMSO液（150微升／ 孔） ， 将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟， 使结晶物溶解。 （4） 酶标仪在490nm处检测各孔OD值记录结果， 绘制细胞生长曲线 CCK-8试剂盒 原理： Cell Counting Kit-8（CCK-8试剂盒） 是检一种基于水溶性四唑盐的广泛应用快速高灵敏度检测试剂盒， 为MTT法的替代方法， 试剂盒中采用水溶性四唑盐在电子耦合试剂存在的情况下， 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。 细胞增殖越多越快， 则颜色越深； 细胞毒性越大，则颜色越浅。 对于同样的细胞， 颜色的深浅和细胞数目呈良好线性关系。用于测细胞增殖、 细胞存活和细胞毒性。 2、 细胞分裂指数 分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比， 它是测定细胞周期的一个重要指标， 也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 体外培养细胞生长、 分裂繁殖的能力， 可用分裂指数来表示。 它与生长曲线有一定的联系， 如随着分裂指数的不断提高， 细胞也就进入了指数生长期。 如何计算细胞分裂指数？ 步骤 a. 消化细胞， 将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 b. CO2培养箱中培养48小时， 使细胞长在盖片上。 c. 取出盖片， 按下列顺序操作： 1） PBS漂洗3分钟→甲醇： 冰醋酸=3： 1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 2） 盖片晾干后反扣在载玻片上， 镜检。 3） 计算: 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数× 100% 3. 细胞周期 （1） 放射性核素标记自显影 用3H标记脱氧胸腺嘧啶核苷 处理30min后， 每间隔30min取材，直到48h为止， 观察和计算细胞分裂相出现时间、 高峰和消失分裂相数， 绘图分析。 （2） 流式细胞仪测定法 4、 培养细胞活力测定 细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。 任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成， 从形态上区别死、 活细胞是困难的。 1) 细胞克隆形成率实验 克隆形成试验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一， 其基本原理是单个细胞在体外增殖6代以上， 其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见的克隆。 克隆形成率用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率＝克隆形成数／ 接种细胞数， 通过计数克隆形成率， 可对单个细胞的增殖潜力作定量分析， 了解细胞的增殖率和对生存环境的适应性。克隆形成率高者其独立生存能力强。 这种方法常用于抗癌药物敏感性试验、肿瘤放射生物学试验等。 常用的方法有平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验。 缺点： 操作繁琐 优点： 精确、 可靠 2) 台盼蓝法 活细胞不被染色， 死细胞染成蓝色， 用活细胞占 细胞中的百分比表示细胞活力 台盼蓝排斥试验： ① 台盼蓝浓度： 母液： 4%， 用双蒸水配制； 工作液：0.4%， 用PBS稀释。 ② 稀释倍数： 台盼蓝工作液： 细胞悬液 = 1： 9 ③ 结果判断：镜下观察见死细胞被染成淡兰色， 活细胞不着色。 ④ 细胞活力的计算 活细胞率 = 活细胞总数 / （活细胞总数+死细胞总数） × 100% （三） 培养细胞种属鉴定方法1、 荧光抗体染色鉴别细胞的种属 间接荧光抗体染色技术—采用兔产生的特异性抗血清标记待测细胞和阳性细胞、 阴性细胞。 加标记有荧光染料（FITC） 的山羊抗兔免疫球蛋白抗体。 后加上的荧光抗体将结合到已标记有兔抗体的靶细胞上， 借助荧光即可看到抗原－抗体复合物。 2、 同工酶谱系鉴别细胞种属 通过确定三种同工酶系统（6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD） ， 乳酸脱氢酶（LDH） 和核苷磷酸化酶（NP） 的垂直淀粉胶电泳的迁移率， 可以鉴定细胞系的种属来源。 该法有高度的可靠性， 简单、 重复性好。 利用同工酶分析检验细胞的交叉污染。 G6PD、 LDH、 NP的电泳迁移率差异不仅可用来鉴别细胞系所属种属， 还可查出种内细胞的交叉污染。 根据同种异体同工酶的表型和正常人群体的表型频率资料， 可以估计出一特定细胞系遗传特征出现的频率。 3、 染色体分析 多数情况下， 即使普通显微镜观察技术，液足以鉴定不同种的染色体结构的差异。 染色体核型分析足以鉴定不同种间细胞系之间的污染。 亲缘关系近的灵长类细胞系之间和人癌细胞系之间的比较可用Giemsa显带分析。 4、 人主要组织相容性抗原 人主要组织相容性抗原（HLA抗原） 存在大多数有核细胞膜上， 常用抗原检测是用补体依赖细胞毒试验， 用拒染来鉴定细胞活性。 原理： HLA抗体与淋巴细胞表面的相应抗原结合后激活补体，导致细胞膜损伤， 通透性增强， 染料进入细胞， 细胞死亡。 在倒置相差显微镜下观察， 着色的细胞为死亡细胞， 视野下有较多细胞死亡为阳性。 5、 核酸技术 用重组DNA技术和DNA探针技术鉴定和定量培养细胞中等位基因的多态性。magigen.com 相关阅读 细胞与组织培养技术大全(五)动物细胞体外培养细胞同步化与器官培养
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