细胞与组织培养技术大全(五)动物细胞体外培养细胞同步化与器官培养

细胞培养是生物技术研究的基础，随着克隆技术和细胞治疗技术的推广和应用，对细胞培养提出了更高的要求。

如何培养好细胞？

这里，美格君从动物细胞培养开始，和大家一起聊一下动物细胞的培养。

动物细胞培养技术大全

**节 动物细胞培养基础

第二节 动物细胞、 组织培养的方法

第三节 培养细胞的检测和特性鉴定

第四节 动物细胞体外培养举例

第五节 细胞同步化

第六节 器官培养

第四节 动物细胞体外培养实例

◉ 肿瘤细胞的体外培养的发展历史

◉ 上皮细胞培养

◉ 表皮组织培养

◉ 肌肉组织培养

◉ 神经元细胞培养

◉ 肿瘤细胞的体外培养的历史

 1906年， Beebe和Ewing最早成功培养狗的淋巴肉瘤细胞；

 1911年， Carrel**在体外培养了纤维软骨瘤及黑色素瘤细胞。

 1952年， Gey首先成功地建立了世界上**个细胞系——来源于子宫颈癌细胞的细胞系， 并且是恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。

 后来， 口腔癌、 喉癌、 肺癌等细胞系相继建立。 迄今为止， 全球范围内建立的细胞系目前已经超过三位数。

发展成就

 在培养的肿瘤细胞类型上， 经历了从间充质源性的细胞转上皮源性细胞、 再由神经外胚层源性到造血源性的发展历程。

 在培养方法上， 经历了从原代培养到传代培养、 再到细胞系的建立的发展过程。

 培养成分上， 由采用纯血清培养到含血清培养基、 再到无血清培养基三个阶段。

 在对体外培养的肿瘤细胞生物学特性研究水平上， 经历了从细胞水平到亚细胞水平， 再到酶和分子水平的发展时期。

 国内已建立的肿瘤细胞系主要有： 来自白血病患者的淋巴样的J6-1、 悬浮生长型的胃癌SL-795、 上皮型的肝癌SMMC-7721、 鼻咽癌CNE-2、 成骨肉癌OC-8611、 结肠癌THC-8910, 以及多形型的胸膜间皮癌SMC-1等等。

◉ 上皮组织的体外培养

体外培养细胞生长的形态特性：

细胞排列紧密， 细胞形态较为一致， 细胞间质少

上皮组织的体外培养特性： 依赖性、 接触抑制性、 细胞连接、 贴壁生长。

◉   表皮组织的体外培养

 表皮细胞分两类：角质形成细胞、 非角质形成细胞

 角质形成细胞体外培养技术：1975年， 莱因沃德（Rheinwald） 和格林（Green）创立饲养层培养法

上皮细胞培养液： 近年来， 国外一些公司研制了多种成品上皮细胞培养液， 例如适用于角化上皮细胞的KGM， 适用于一般表皮细胞的EGM等， 使用很方便。

 结果及鉴定

培养的细胞必须鉴定， 以排除间充质细胞混杂。 表皮细胞对角蛋白特异性单克隆抗体反应阳性， 间充质细胞对波型丝特异性单克隆抗体反应阳性。 培养初期可观察到上皮细胞的纤维样细胞混杂生长经数次传代后纤维样细胞逐渐消失。

 【3T3细胞常规传代培养和照射处理】

3T3细胞是Swiss鼠成纤维细胞， 在表皮细胞培养中经常用照射处理过的3T3细胞作滋养层， 3T3细胞一般应维持在低密度条件下培养。 在75cm2培养瓶中接种5×10⁶~10⁵个即可， 培养3~4d可获得3~5× 10⁶个细胞， 可再行胰蛋白酶消化、 传代培养。 如果用于照射处理， 将胰蛋白酶消化的细胞悬浮于含10%胎牛血清的MEM培养液中， 在75cm²培养瓶中接种1.5×10⁶个细胞， 在钴源下给予60Gy（6,000rads） 照射剂量， 培养使细胞贴壁， 更换培养液， 待用。

◉   肌肉组织的体外培养

 肌肉组织的特点：

   肌肉组织（肌组织） 细胞间结缔组织少、 血管和神经丰富。 肌细胞长梭形， 又称肌纤维。

 肌肉组织培养： 指将肌肉组织植块或分散的肌肉细胞在离体条件下生存、 生长或发育的技术。

 骨骼肌的培养：基本原理是在体外培养时，在培养基中加入胎牛血清并将细胞接种于明胶上，可使肌肉组织中的骨骼肌单核前体细胞在发生增殖的基础上，进一步向成熟骨骼肌细胞发生分化，即细胞间进行大量的融合、细胞内有横纹形成、细胞可发生自发性的收缩等，由此可得到大量的骨骼肌细胞。

◉ 神经组织的体外培养

 神经组织包括： 神经元细胞和神经胶质细胞

 1907年， 哈里森首创培养方法。 经历了组织块培养→分离细胞培养→单一型细胞阶段

神经原细胞培养

 神经原细胞培养需要极高的营养条件， 培养器皿也需要经过特殊处理， 神经轴突在胶原和聚L—赖氨酸（Poly-L-lysine） 溶液中可以旺盛生长， 神经生长因子（NGF） 可促进神经原的生长。

 从出生4~8d的大鼠脑组织取材培养， 培养液中加入胞嘧啶阿拉伯糖抑制非神经原细胞， 可获得特征明显的脑神经细胞。 基本方法是取新生大鼠脑， 切成小块， 用HBSS胰酶消化， 37℃ 15min， 将细胞悬液接种于聚L—赖氨酸覆盖内底面的培养器皿内进行培养。

【用品】

 DMEM培养液： 其中加有10%热灭胎牛血清， 30m mol/L葡萄糖，293.2mg/L L—谷氨酰胺， 24.5m mol/L KCL， 100mU/L胰岛素，7μmol/L P—氨基苯酸， 100μg/ml庆大霉素

 Hands 平衡盐液， 其中加入牛血清白蛋白3g/L (HBSS)

 聚L—赖氨酸， 分子量大于300,00

 胞嘧啶阿拉伯糖

 Ⅱ 型胰蛋白酶（0.025%， 溶于HBSS）

 硅胶（Aquasil, Pierce 42799）

 3.5cm培养皿， Pasteur滴管， 10ml移液器（无菌）

 12ml和50ml无菌试管、 无菌手术器械、 水浴箱

【鉴定方法】

用神经原特异性烯醇抗体或破伤风毒素作为标记物， 经免疫组织化学检测可判定神经原细胞； 用胶质原纤维酸性蛋白作为标记物可判断混杂在其中的胶质细胞。

◉ 细胞培养目的与用途

1. 药物研究与开发

(1) 新药筛选:如化学合成药物药效研究,中药有效成分筛选与鉴定等.

(2) 疫苗研究与开发:如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.

(3) 基因工程药物研究与开发:如干扰素研究与开发,细胞生长因子研究与开发等.

(4) 细胞工程药物研究与开发:生物活性多肽研究与开发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发.

(5) 单克隆抗体制备:包括诊断用单克隆抗体,治疗用单克隆抗体.

2, 生物制药

(1) 疫苗生产:如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等.

(2) 基因工程药物生产:如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素,粒细胞生长因子,胸腺肽等 (3) 诊断用和药用单克隆抗体生产

(4) 细胞工程药物生产:生物细胞内的一些生物活性多肽,生物活性物质等

3. 基础研究

(1) 药物作用机理

(2) 基因功能

(3) 疾病发生机理

◉ 动物细胞体外培养现状与展望

* 目前存在的主要问题:

（1） 细胞密度低,产物浓度低。

（2） 细胞群体在大规模,长时间培养过程中分泌产物能力易丢失,或产物活性易降低。

（3） 动物细胞培养基、 培养设备以及培养用微载体昂贵。

（4） 目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺。

（5） 在线监控水平技术不完善， 限制了优良培养系统的开发。

第五节 细胞同步化

什么是细胞同步化培养？

细胞同步化培养是指用自然或人工方法获得细胞群体的细胞周期同步化生长。

细胞同步化培养的方法

1. 筛选同步化细胞

    ● M期细胞震荡脱落法

    ● 离心洗脱法

    ● 梯度沉降法

2.   诱导同步化细胞

     ● 血清饥饿法

     ● 异亮氨酸营养缺乏法

     ● DNA合成抑制剂阻断法

     ● 秋水仙素阻断法

第六节 器官培养

什么是器官培养

1 定义与特点

 器官培养： 取出动物器官或进一步修整成器官型植块， 将其培养使其存活和生长的过程。

 1897年， 利奥勃（Leob） 首创。

人体器官培养的共同点：

（1） 培养对象为胚胎组织的某一器官或非胚胎组织器官的一部分

（2） 被培养对象浸泡在培养液中

（3） 培养器官从培养液中获氧及养料， 同时排废物

器官培养特征

（1） 被培养的器官在体外存活较长时间， 并保存相对正常的功能， 器官内的细胞有正常的代谢甚至增殖。 而器官保存无细胞增殖

（2） 被培养物为一完整器官或具有完整功能的某一器官的一部分， 如肝

（3） 器官培养不能从一个变成多个， 而细胞培养过程中有细胞量的增加

2 器官培养技术

 器官培养可分为： 胚胎器官培养和成年器官培养

 培养原则：

① 提供充足的氧气和养料， 及时排除废物。

② 抑制细胞从植块向外迁移

传统的器官培养方法

（1） 表玻璃器官培养法：1929年， 费尔（Fell） 和鲁滨逊 （Robinson）建立

（2） 琼脂凝胶培养法： 沃尔夫（Wolff） 和施奈德（Schneider）

（3） 悬浮培养法

（4） 直接漂浮培养法：1948年， 梅达沃（Medawar） 设计

（5） 擦镜纸培养法

  (6） 金属格栅器官培养法：1954年， 特罗尔（Trowell） 创立。

（7） 琼脂小岛器官培养法

（8） 陈氏滤纸虹吸器官培养法：1964年， 陈瑞铭发明。

（9） 旋转管培养法：1933年， 盖尔（Gey） 建立。

（10） 摇摆式器官培养法：1976年， 巴雷特（Barret） 创立

现代器官培养——灌流式器官培养法

1938年， 卡雷尔（Carrel） 和林德伯格（Lindberg） 开始尝试进行现代器官培养。

现代器官培养应用举例

（1） 软骨的培养

（2） 神经组织的器官培养

（3） 血管的培养

（4） 肝脏的培养

一种长时间灌流式器官培养装置

器官培养最新进展

● 生物反应器培养拇指指骨

● 在猪身上培育人体动脉

● 生物工程人造肾脏、 乳腺、 膀胱、

● 人造角膜

● 1996年， 我国曹谊林教授培养出 “人耳” 。

● 2020年，瑞士洛桑联邦理工学院EPFL生物工程研究所的Matthias Lütolf实验室已经开发出了一种合成的水凝胶，避开了自然衍生的凝胶的传统局限性，用人工水凝胶将肠道干细胞培养成微型的肠。

图1. EPFL生物工程研究所的Matthias Lütolf实验室培养从Mini肠。

● 2023年，中科院广州生物医学与健康研究院团队成功制造出包含人细胞和猪细胞的嵌合胚胎 。移植到代孕母猪体内28天后，发育中的人源肾脏结构和肾小管形成正常。这是科学家们**次能够在另一个物种体内培养出一个实体人源器官。

图2. 胚胎内的人源化肾细胞（红色荧光）与野生型猪胚胎对比

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