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如何进行rAAV病毒包装?rAAV载体构建

作者:载体构建

病毒包装

腺相关病毒AAV包装流程

自然界中的天然野生型腺相关病毒的基因组上存在Rep和Cap基因,而实验用的AAV载体,是在野生腺相关病毒的基础上经过人工改造的质粒,基因组上已经去除了Rep和Cap基因,因此也叫重组腺相关病毒(recombinant AAV,rAAV)。在没有特别指出的时候,简称AAV一般指已经改造过的AAV载体。

如何进行rAAV病毒包装?

rAAV载体的生产流程

rAAV重组腺相关病毒的生产主要基于三质粒,核心质粒pAAV-GOI/shRNA、血清型质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper,共转染HEK293T细胞。包装细胞反式提供rAAV的结构蛋白Cap及功能蛋白Rep,并在辅助质粒pHelper的帮助下,高效地将带有ITR的靶标DNA片段包装到rAAV病毒颗粒中。


AAV包装步骤2.jpg

图1 rAAV的生产流程


1. rAAV载体构建

① 根据实验目的和受试细胞选择不同的rAAV载体。一般通过简单酶切-连接-转化-测序的方式将目标基因克隆至rAAV表达载体,并验证载体表达功能。

② 为了获得高质量、高浓度且低内毒素含量的质粒,通过柱离心法及去内毒素试剂进行质粒DNA纯化。


rAAV核心质粒构建流程图.jpg

图2 rAAV核心质粒构建流程图


2. rAAV 病毒包装流程(293T贴壁)

① 细胞准备

从液氮灌中取出冻存细胞,迅速放入37℃水浴锅中复苏,离心后向细胞中加入新鲜培养基,37℃、5%CO2条件下培养,每2-3天进行细胞传代;待细胞生长正常后转入10cm的培养皿中贴壁培养备用。


② 质粒转染

当细胞密度达到约80~90 %的汇合率即可进行转染,将转染三质粒体系按照一定比例配置后,按照每皿1000μL体系进行转染及培养。


③ 细胞培养

培养一天后,通过显微镜观察细胞转染情况。一般情况下需转染效率在80%以上,转染率过低会导致病毒产量下降。


④ 病毒收毒及除杂

培养72hr后,收集病毒上清。将病毒培养上清液低温离心去除细胞碎片,并加入适量核酸酶,37℃去除游离的核酸,然后加入PEG8000/NaCl溶液过夜聚沉。


⑤ 病毒纯化及浓缩

将聚沉的病毒用PBS进行重悬并置于超速离心机进行密度梯度离心;离心后,抽取病毒对应层的溶液,利用透析袋进一步4℃透析过夜;第二天将透析液0.22um过滤,并通过浓缩管进行浓缩和清洗,达到除杂和浓缩的目的。


3、rAAV载体质量检测

腺相关病毒的质量主要包括滴度检测、纯度检测、无菌检测、支原体检测及内毒素检测。


① 滴度检测

检测方法:完整的rAAV病毒粒子含有1个拷贝的基因组DNA,将病毒样品进行酸碱裂解处理,使其暴露出基因组DNA。进一步利用特异性的引物进行荧光定量PCR实验,检测rAAV病毒粒子的DNA拷贝数,即rAAV的数量VG(Viral genomes),换算成单位体积中rAAV的含量,即rAAV的滴度VG/mL(Viral genomes/mL)。

QC标准:滴度≥1.0E+12 VG/mL

② 纯度检测

检测方法:利用SDS-PAGE方法对病毒样品进行纯度检测。

QC标准:银染染色结果中,只有VP1 、VP2 、VP3 三种蛋白的染色条带,亮度比约为1:1:10且无明显杂带。

③ 无菌检测

检测方法:将病毒样品接种到适于各菌生长的培养基中,37℃培养7天后,检测细菌和真菌的生长情况。

QC标准:培养基需澄清透明,无任何细菌及真菌污染。

④ 支原体检测

检测方法:利用支原体16S rRNA基因的保守区设计引物,通过凝胶电泳和荧光定量检测病毒样品中有无支原体的污染。

QC标准:PCR胶图无条带。

⑤ 内毒素检测

检测方法:按照内毒素检测鲎试剂盒(试管定量显色基质法)使用说明书进行操作。

QC标准:<10EU/ml


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CRISPR Cas9C002S70pmol/盒489
CRISPR Cas12bC006S100pmol/盒1480
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CRISPR Cas14aC015S100pmol/盒1280
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单链RNA荧光探针C011S50 test239
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