用粪便滤液移植技术预防新生儿坏死性小肠结肠炎

新生儿出生后肠道定植对宿主免疫系统的发育至关重要。然而，越来越清楚的是，导致偏离正常肠道微生物群发育轨迹的微生物扰动是一个风险因素，这可能是一系列新生儿疾病的促成因素。由于早产儿的微生物宿主防御功能受损、以及对威胁生命的感染的高度易感性，肠道生态失调是早产儿特别应该关注的问题。

新生儿坏死性小肠结肠炎NEC是一种致命的炎症和坏死性肠病，主要影响早产儿，是一种与肠道失调密切相关的疾病的典型例子，目前尚无法预防。早产儿肠道微生物群之间的主要差异使明确的与NEC相关的微生物群的解析复杂化，但蛋白质细菌的增加和类杆菌相对丰度的降低是新生儿中预诊断NEC微生物群的统一特征。

在单一医院场所，NEC诊断前的微生物群通常表现为细菌多样性减少、专性厌氧菌缺乏，以及通常属于肠杆菌科的单一兼性厌氧菌相对丰度增加。

粪便微生物群移植FMT是一种很有前途的预防性治疗方法，但其中病原微生物或有毒化合物的转移引起了人们的关注。

为了寻找更好的细菌疗法，预防新生儿坏死性小肠结肠炎，由丹麦哥本哈根哥本哈根大学健康与医学科学院兽医动物科学系的Thomas Thymann博士领导的团队对FMT技术进行了改进，采用粪便滤液移植技术FFT来预防新生儿坏死性小肠结肠炎。他们的研究成果近日发表在《自然》杂志。

粪便滤液移植技术是通过微孔过滤，去除供体粪便中的细菌，这样可以降低细菌感染的风险，而残留的噬菌体可以保持坏死性小肠结肠炎NEC的预防效果。

为了评估粪便滤液移植FFT的临床前有效性和安全性。研究人员使用了健康乳猪的粪便材料。

研究人员使用剖宫产生产的小猪作为早产儿的模型，当作受体，母乳喂养足月猪作为供体，证明了粪便微生物群移植FMT对抗NEC的原理。

尽管FMT对肠道病理学的有益作用是明确的，并且在受体中存在明显的有益供者细菌植入，但口服FMT时，安全性引起了一些关注，如败血症发生率和死亡率的增加。

除细菌外，粪便基质还包括古细菌、真核生物、病毒、微生物分泌组和代谢组，其中任何一种都可能归因于FMT的优点和缺点。

因此，任何降低供体粪便基质复杂性的方法，同时保持其治疗效果，都是朝着开发临床上可行的NEC治疗方法的方向迈进。

噬菌体是以宿主特异性方式感染细菌的病毒，在包括哺乳动物肠道在内的所有含细菌生态系统中无处不在。

在早期肠道定植期间，噬菌体和细菌动态地相互作用，并影响彼此的组成。

接受无菌供体粪便滤液移植FFT的一系列艰难梭菌感染小病例报告的治愈率相当于常规FMT治疗，并将其归因于供体噬菌体。

在小鼠中，从瘦供体到接受高脂肪饮食的受体的FFT可以减少体重增加，并防止代谢综合征的发生。因此，噬菌体可能调节了FMT对NEC的有益作用。

研究人员假设FFT在预防NEC方面与FMT一样安全有效。他们使用剖宫产的早产猪作为早产婴儿的模型，通过不同给药途径，与FMT和对照组比较FFT的临床和肠道微生物学效应。研究数据表明，FFT相对于FMT具有优越的疗效、安全性。FFT受体的粘膜微生物群在噬菌体中富集，NEC相关细菌被去除，并且与FMT不同，这是在没有显著诱导宿主粘膜免疫的情况下实现的。FFT是一种全新的预防方式，有可能大大减轻NEC带来的负担。

图1.   FFT肠道病理评估。

材料和方法

动物实验程序

丹麦动物实验检查局批准了所有实验程序（许可证编号2014-15-0201-00418）。

来自三头健康母猪在妊娠90%时剖腹产下75头常规杂交仔猪。

研究人员根据性别和出生体重对动物进行分层，并将它们随机分为四组（图1A），分别接受粪便微生物群直肠移植（FMT）、粪便滤液直肠转移（FFTr）、粪便滤液口胃转移（FFTo）或生理盐水作为对照（CON）。

所有动物均通过管饲方式增加婴儿配方奶粉的摄入量（24-96ml/kg/d），同时减少肠外营养补充（96-48ml/kg/d）。

粪便微生物群和滤液移植

收集5只10日大的仔猪的结肠腔内容物，然后汇集，轻轻混匀，并在10%无菌甘油中冷冻。

对于FMT溶液，解冻的粪便材料在无菌盐水中稀释至0.05 g/ml，并通过70µm细胞过滤器过滤。

如前所述，预先制备FFT溶液。简单地说，将解冻的粪便材料稀释至上述浓度，混匀，在5000g, 4℃下离心 30分钟，并用0.45 µm PES过滤器（Minisart）过滤上清液。

纯度和病毒类颗粒浓度通过SYBR金染色和表观荧光显微镜进行评估，细菌细胞很容易通过大小和荧光强度进行区分。

动物在出生后第1天和第2天每天两次，接受0.5 ml处理液。直肠给药（CON、FMT、FFTr）使用软橡胶探针在肛门3-5CM处注入直肠，而口胃溶液（CON，FFTo）注入喂食管，然后用1 毫升无菌水冲洗。

临床监测与安乐死

由经验丰富的人员对动物进行监测，并记录每日体重和粪便模式。在整个实验过程中，出现NEC或系统性疾病临床症状的动物立即被安乐死。

第5天，对动物进行深度麻醉，并通过心脏注射巴比妥酸进行安乐死。如前所述，通过尿乳果糖与甘露醇的比率评估肠道通透性。

切除腹部器官，并称重，由一名不知情的病理学家根据建立的六级NEC评分系统评估胃、小肠和结肠的大体病理变化。

指定的***别表示疾病的严重程度，NEC诊断定义为病理级别4（广泛出血）或以上。从升结肠收集肠腔内容物，用于肠道微生物群分析。

沿小肠收集三个活检标本，用于乳糖酶活性测量。远端回肠和升结肠的活检用多聚甲醛固定，随后用石蜡包埋，切片，并用苏木精和伊红染色进行组织病理学评估，其中显微镜下NEC被定义为组织病理学等级4级或以上。

最后， 将10CM的远端回肠切片倒置，在无菌生理盐水中洗涤，并吸去残余液体。然后用无菌物体玻璃刮去粘膜组织，冷冻保存以进行肠道菌群分析和宿主转录组分析。

16srRNA基因扩增子测序

使用Illumina NextSeq， v2 MID，300循环，配对末端化学，采用16S rRNA基因（V3区）扩增子测序，测定远端回肠粘膜和肠腔内容物的细菌组成。

根据制造商的说明，使用Bead-Beat Micro AX Gravity 试剂盒（A＆A Biotechnology，Gdynia，Poland）提取总DNA。

文库准备遵循先前发布的协议。平均扩增子测序深度为每个样品35840个读数（最小9286个读数和**63584个读数）。

有关16S rRNA基因扩增子测序生物信息学工作流程的详细说明，请参阅补充方法。

病毒体测序

来自相同肠粘膜和腔样品的病毒含量被纯化，DNA提取和文库构建，测序和分析，如前所述。病毒宏基因组的平均测序深度为每个样品6158777个读数（最小72077个和**13788165个读数）。病毒体测序生物信息学工作流程在补充方法中有详细介绍。

转录组测序RNA-Seq

通过转录组测序RNA-Seq方法研究回肠粘膜RNA提取物中的全局转录组模式。用RNeasy Micro Kit（Qiagen）分离总RNA，每个样品1.5μgRNA用于文库构建。

使用用于Illumina的NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（NEB）构建测序文库，并在Illumina HiSeq 4000平台上测序，产生双末端150bp读数。转录组测序RNA-Seq生物信息学细节可在补充方法中获得。

系统免疫细胞表征

如前所述，在第3天和第5天收集的血液样本中进行全血细胞计数和基本T细胞表型分析。

统计

通过Kruskal-Wallis检验分析NEC评分和尿乳果糖-甘露醇比率。通过Fisher精确检验分析NEC发病率，直肠出血和生长衰竭发生率。通过双向ANOVA分析三个小肠段的加权乳糖酶活性，并通过单向ANOVA分析剩余的连续数据。低于0.05的概率水平被认为是显着的。

结果

初始临床过程

在75例剖宫产早产仔猪中，9例在随机分组前被排除（例如复苏失败，死产），而其余66只动物被分组。

由于与干预无关的原因（呼吸衰竭，医源性并发症），另外7只被预先安乐死。

预先用临床NEC体征（1 CON，1 FFTr）对两只动物实施安乐死，而剩余的57只仔猪存活至第5天。

在实验过程中，相对于两个FFT组0%的直肠出血率（p<0.05 vs. CON），31%（5/16）的CON直肠出血，19%（3/16）的FMT动物直肠出血。

肠道病理评估

研究人员对回肠和结肠组织病理学评估支持的胃肠道进行了大体检查，以评估NEC样病变的严重程度和程度。

配方奶喂养的早产猪的NEC样病理表型包括广泛出血，伴有或不伴有粘膜和肠道的斑片状坏死，主要影响上行和横结肠，并且在较小程度上影响回肠和胃（图1B）。

在微观水平上，病理学观察包括粘膜结构的细微变化，从最严重的病例中上皮脱落和出血，进展到完全破坏粘膜完整性（图1C）。

在这种情况下，口胃FFT给药显着降低了肉眼可见的NEC严重程度（p<0.01，图1B），因此NEC发生率降低至0%（p<0.01 vs.CON）。

直肠给药的FFT也降低了NEC的严重程度（p<0.01），但相对于CON则没有发病率。

然而，研究人员之前发现直肠给药的FMT明显具有NEC保护作用，但相对于CON，未能降低NEC的严重程度和发病率。

直肠给药后没有出血，直肠给药仔猪尸检时没有观察到直肠损伤。显微镜评估支持口胃FFT的宏观效应，相对于CON和FMT，其降低了组织病理学NEC严重程度和发生率（所有p>0.05，图1C），而对于直肠施用的FFT没有发现显着影响微观层面。

安全评估

研究人员接下来调查了一系列安全参数。最初，发现与CON和FFTo相比，FMT组动物具有显着更高比例的身体负生长速率（均p<0.05）。

此外，相对于FFTo，FMT动物中小肠、但不是结肠的相对重量较低。

此外，FFTr强烈降低了尿乳果糖-甘露醇比率（小肠通透性的体内标志物），而FMT组的通透性显着高于两个FFT组。

最后，相对于FFTr，FMT组的乳糖酶活性（粘膜完整性的量度）显着降低。

肠道粘膜和管腔的细菌组成

一般来说，粘膜相关细菌的组成不同于管腔细菌。

干预效果在粘膜和管腔的细菌组成中都可以看到.

FMT组的效果**，但两个FFT组在粘膜和肠腔方面也与CON有显著差异。然而，FFT给药途径（FFTr与FFTo）并不影响细菌组成。

各组间粘膜相关细菌的Shannon指数相似，但Shannon指数与小肠NEC严重程度呈正相关。

管腔细菌香农指数仅在FMT处理后增加。

与CON相比，在FMT动物的腔室内观察到大多数相对差异丰富的细菌OTU，而不同处理之间差异丰富的粘膜相关细菌的数量具有可比性。

与CON相比，FFT处理显著增加了链球菌的相对丰度，但没有增加乳酸杆菌的相对丰度，而FMT相反增加了乳酸杆菌的相对丰度，但没有增加链球菌的相对丰度，尽管供体粪便中含有这两种属的高比例。

虽然各组肠腔中蛋白细菌的相对丰度（约10%）相似，但从口服-胃给药FFT动物的粘膜中检测到<1%的蛋白细菌，而约10%的CON粘膜微生物群由蛋白细菌组成（例如肠杆菌科、克雷伯菌属），FMT约5%。

肠道粘膜和管腔的病毒和噬菌体组成

FMT动物的管腔病毒组与所有剩余组不同，两个FFT组与CON组不同，而FFT给药途径的影响仅具有临界显著性。

与细菌相反，粘膜相关病毒的香农指数在FMT和FFTo后增加，但FFTr与CON相比没有增加。

在腔室内观察到相同的病毒香农指数模式。未观察到粘膜病毒香农指数与小肠NEC严重程度之间的相关性。

虽然也鉴定出了真核病毒，但相对丰度较低（小于1%），但这些组中的大多数可识别病毒是原核病毒（噬菌体），主要属于尾状病毒目。

值得注意的是，尽管FMT导致相对于CON的真核病毒家族（如疱疹病毒科）的粘膜和管腔富集，但FFT治疗并非如此。

FMT受体肠腔中相对差异丰富的病毒OTU数量再次最高，但对于粘膜相关病毒组，口服而非直肠FFT给药改变的病毒OTU相对丰度与FMT相同。

值得注意的是，自然捕食肠道细菌的噬菌体家族微绒毛科的几个成员仅在口服FFT组的粘膜中相对丰富。

宿主肠道粘膜转录组分析

为了深入了解宿主粘膜对治疗的反应，我们对回肠粘膜样本进行了RNA-Seq分析。

最初，主成分图显示FMT组沿第二主成分与其余组分离。

值得注意的是，对于两个FFT组，我们没有发现与CON相关的具有统计学意义的差异表达基因，而与CON相比，FMT增加了86个基因的表达，减少了41个基因的表达。

应用差异倍数标准时（log2 > 1） 与CON相比，FMT分别上调和下调了29个和16个已知基因。

对差异表达基因的网络分析表明，脂多糖（LPS）反应基因（如TLR4、CD14、THEMIS2、TNIP3）是FMT富集网络中的关键基因，而IFIT1和OASL等干扰素诱导基因则被FMT下调。

事实上，FMT和CON粘膜中差异表达基因的功能注释表明，受影响最显著的途径与免疫激活和宿主防御机制有关。

有趣的是，FMT上调了与细菌反应途径相关的基因，下调了与病毒反应相关的基因。

系统免疫细胞特性

最后，研究人员测量了干预后不久和安乐死时血液中基本免疫细胞亚型的水平，以研究系统免疫的任何诱导。

在第3天，即最终治疗给药后不久，我们发现所有干预组的中性粒细胞计数相对于CON略有增加，而单核细胞和总淋巴细胞水平不受影响。

然而，辅助性T细胞（CD4+CD8−) 和原始T细胞分数（CD4−CD8−) 与FFTr相比，在FMT中分别增加和减少。

两天后，这些差异都消失了。

由于早产儿极易感染，合理的NEC预防策略需要无可争议的安全性。Thymann团队用一个临床相关的动物模型中表明，FFT与FMT相反，能有效预防新生儿坏死性小肠结肠炎，且无任何可识别的副作用。

参考文献

Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis

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