G-triplex-CRISPR-Cas12a，一种全新、灵敏的快速检测方法

作者：LI TAO

摘要

CRISPR Cas12a（Cpf1）可以反式切割ssDNA，该特征已被广泛用于核酸检测。

在这里，我们介绍了一种新型的Cas12a报告基因，G-triplex（G3）和一种称为G-CRISPR的高灵敏度生物传感器。

我们证明CRISPR Cas12a可以在约10分钟内反式切割G3结构，利用这种切割诱导的高级结构破坏方式，G3可以作为出色的报告子。

G3报告基因将检测灵敏度提高了20倍，对于未扩增和扩增DNA，检测灵敏度分别到低至50 pmol和0.1 amol（一拷贝/反应）。

G-CRISPR已被用于分析具有HPV感染风险的27个PCR扩增患者样品，分别利用荧光和侧流测定，两者结果100%的一致性。

与临床结果相比，其总体特异性和敏感性分别为100%和94.7%。这些结果表明，G-CRISPR可以作为快速，灵敏和可靠的生物传感器，并可以进一步扩展CRISPR工具在生物医学诊断中的应用。

1. 介绍

CRISPR/Cas系统作为细菌和古细菌的适应性免疫系统，可以保护它们免受入侵噬菌体、病毒和质粒的侵害。

在病原体与其宿主之间的相互作用期间，CRISPR-Cas机制在CRISPR RNA（crRNA）的指导下切割特定的DNA。

随着许多CRISPR-Cas蛋白如Cas9，Cas12a，Cas12b, Cas13和Cas14的出现，科学家们已经利用这一特性来彻底改变基因编辑。

最近，越来越多的研究表明，某些CRISPR-Cas蛋白在靶向特异性切割（称为顺式切割）后，在非特异性靶标上表现出附带切割（称为反式切割）属性。

利用这一特殊属性，人们已经开发了许多基于CRISPR的护理点（POC）平台（例如SHERLOCK），用于人类基因分型和病原体检测，具有高特异性和灵敏度。

在CRISPR蛋白中，CRISPR Cas12a（也称为Cpf1）提供混杂的核酸内切酶活性，其反式切割的是ssDNA（不是dsDNA和RNA）。

Chen等人使用ssDNA作为报告基因，建立了“DETECTR”平台，实现了对人乳头瘤病毒（HPV）的阿托摩尔（aM）级别灵敏度的检测。

Li等人实施了类似的ssDNA-FQ报告基因，并开发了一种名为'HOLMES'的系统，并检测了伪狂犬病病毒（RNA）和日本脑炎病毒（RNA）。

其灵敏度约为10aM，用于检测放大目标。此后，人们已经提出了许多其他策略，来优化基于CRISPR Cas12a蛋白的平台的性能，

例如使目标类型多样化（例如，将适体组合以检测蛋白质，除DNA/RNA之外的小分子），又比如，简化操作方案（例如，自动样品提取，一管检测），避免使用读取器。

优化的另一个关键目标是提高检测灵敏度，这可以减少检测时间而不牺牲早期病毒感染期间的准确性。

例如，研究人员引入了两种crRNA，并用Mn2+取代Mg2+以增加Cas12a蛋白活性，两者都实现了几个核酸拷贝的检测灵敏度。

然而，据我们所知，目前基于CRISPR Cas12蛋白的检测系统通常使用ssDNA作为报告基因，这使得进一步提高灵敏度受到限制。

G-triplex-CRISPR-Cas12a，一种全新、灵敏的快速检测方法,G CRISPR

图. G-CRISPR-Cas12a检测原理、流程

最近，我们报道了活化的CRISPR/Cas12a系统、反式切割DNA G-四联和体（G4s）。

然而，由于其高稳定性，需要很长时间（长达数小时）切割G4结构。G-triplex（G3）是一种类似G4的DNA模体，具有三链非规范二级结构，可由富含鸟嘌呤的DNA序列，通过Hoogsteen类氢键形成。

G3最初被认为是具有潜在重要细胞功能的G4的中间形式，进一步的研究显示，少数序列可以形成稳定的G3结构，尽管不如G4稳定。

G3与G4具有多种性质，例如，对许多刺激，如金属离子，氯化血红素，硫黄素T，敏感，因此它已经被用于各种类型生物传感器。

例如，通过从G4序列截短四个碱基（GGGA）获得的G3序列似乎显示出与亚甲蓝（MB）的强亲和力，并且可以通过亚甲蓝稳定。

该特征被用于开发用于灵敏检测可卡因的电化学生物传感器。

在这项工作中，我们发现CRISPR Cas12a蛋白可以反式切割G3，并基于这一发现开发了一个敏感的核酸检测平台。我们选择了两个典型的G3序列，TBA11（凝血酶结合适体截短形式，简称TBA）和端粒G3，据报道它们不太稳定，并研究了Cas12a蛋白对它们的切割活性。

结果表明，CRISPR Cas12a在几分钟内反式切割两种G3结构，切割速率远高于G4。

我们用荧光光谱，圆二色（CD）光谱，凝胶电泳和核磁共振（NMR）实验验证了这种反式切割活性。

由于G3对各种刺激作出反应，并且可以被CRISPR Cas12a系统快速降解，因此它可能是基于其在切割之前和之后的高阶结构变化、构建快速生物传感器的有希望的报道基因。

因此，我们通过将CRISPR-Cas12a与TBA11-G3报道分子整合，来开发G-CRISPR平台。

使用G-CRISPR，我们成功区分了SARS-CoV-2和SARS-CoV N基因，以及HPV16和HPV18 L1基因质粒。

该系统分别对未扩增和扩增的HPV16质粒实现了50 pM和0.1 aM（每个反应单拷贝）的检测灵敏度，比基于ssDNA报告分子的CRISPR Cas12a系统提高了20倍。

此外，我们使用基于荧光和侧向流动的G-CRISPR测定，证明了27个患者样品中HPV16和HPV18的检测是成功的。

结果与临床报告高度一致，特异性和敏感性分别为100%和94.7%。

总体而言，G-CRISPR为核酸检测提供了高灵敏度和准确性，并具有进一步扩展CRISPR Cas12a生物传感工具的巨大潜力。

2. 实验材料

G-triplex (G3), G-quadruplex (G4), 和crRNA序列均来自中国上海Sangon公司。

利用PCR方法，分别从pUC57-SARS-CoV-2-N、pUC57-SARS-CoV-N、pUC57-HPV16-L1和pUC57-HPV18-L1载体中扩增SARSCoV-2-N基因、SARS-CoV-N基因、HPV16-L1基因和HPV18-L1基因。

PCR-Master-Mix从中国上海Yeasen公司购买，质粒的PCR产物在使用前通过Axygen公司凝胶提取试剂盒纯化。

所用引物和载体由Tsingke公司（中国北京）合成。使用的DNA和RNA序列列在支持信息中（表S1）。

DNA琼脂糖和核酸凝胶染色剂购自Yeasen公司。TEMED、（NH4）2S2O8、尿素、30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液和10%× TBE缓冲液购自Bio-Rad Laboratories（Hercules，CA）。

Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cas12a（Magigen CRISPR LbCas12a蛋白）购自中国广州美格生物科技公司。

横向流动免疫层析试纸条（Milenia HybriDetect 1）来自英国TwistDx公司。

参考文献

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