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什么是内标基因?外源性内标和内源性内标的区别

作者:分子检测

分子检测技术

内标基因

在新冠病毒检测中,核酸检测技术准确率非常高,是确认新冠肺炎感染者确诊的"金标准"。但是,就是最准确的核酸检测技术也会出现假阴性现象。


为了降低假阴性的出现,在核酸检测试剂加入内标基因的检测,通过检测内标基因,来质控采样含量、核酸提取、核酸扩增过程。


什么是内标?

内标,英文是 internal control,是指内部检测标准,通过内标的设置,来监控核酸提取和扩增过程,防止假阴性。

“内标”基因是反应核酸检测质量的重要指标之一,通常指实时荧光定量PCR中的内参基因,能够对单个待测样本本身的检测环节进行监测,可作为质控品的有力补充。


为什么需要内标?

内标的用途

假设我们需要在两个样本中比较目标基因的表达情况,其中一个样本的细胞系经过了处理,另一个没有经过处理。当实验完成,我们发现,两个样本之间相差一个CT值,那么这意味着目标基因在两个样本中有两倍的目标差异。

但问题是,我们怎么知道这两倍的差异是真的呢?会不会是因为在样本或者提取的时候有些问题,导致未处理细胞系和处理过细胞系的cDNA浓度不同,从而导致了这两者之间的差距?

qPCR检测过程中产生的mRNA的数量差异不仅取决于基因活性,还取决于实验条件,特别是cDNA的初始量。为了获得有效的结果,你需要从处理过的和未处理过的样本中以完全相同量的cDNA开始,这很难实现。

幸运的是,这个问题有了解决方案。如果在每个样本中加入第二个已知不受处理影响的基因,则检测到的mRNA的任何差异都将是起始cDNA浓度变化后的结果。目标基因和第二个基因同时被扩增,比较第二个基因和目标基因之间的基因表达模式,可以得出“真实”的倍数变化。这第二个基因是被称为"内标"的基因。


核酸检测内标的设置有两种模式:


1. 内源性内标/内标基因

2. 外源性内标

什么是内标基因?

内标基因,英文是endogenous internal control,也称管家基因house-keeping gene、内参基因,通常选择在生物体各类细胞都能表达的基因,采用的是样本当中固有的人细胞中的管家基因,管家基因因为其表达水平受环境因素影响较小,而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的管家基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。


以下归纳了几种常用的内标基因。

部分常用的内标基因

中文名称

RNasn P核糖核酸酶P
GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶
B2M人类B2M内参引物
18sRNA核糖体RNA
TBPTATA结合蛋白(转录因子TFⅡD的组分之一)
β-actin肌动蛋白(细胞的重要骨架蛋白)
HPRT次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶

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内标基因虽然可以质控包括采样检测整个流程,但它的高表达性,也不能保证采样的准确性,想要采集合格的鼻咽试子还得规范的操作规程和技术规范。只有高质量的标本,内标基因才能发挥其流程质控的作用。

外源性内标,英文是exogenous internal control,是外加到提取溶液中的、人工设计合成的与模板扩增效率相似的一个基因片段。由各个生产企业制备,不同厂家之间不建议混用。外源性内标采用的为非人源基因作为内标,是假病毒或质粒,在提取之前加入,监测核酸检测的样本提取、PCR扩增过程,不能监测取样过程。


外源性内标和内源性内标的区别


外源性内标

内源性内标
内容以非人源基因作为内标,在提取之前加入,监测核酸检测中的提取、扩增等环节;主要包括质粒、假病毒等。

以人源基因作为内标,存在于人的基因组中,可以监测核酸检测的全流程,包括采样、提取、扩增等环节;主要包括RNase P(多为RPP30)、GAPDH等。

优点

更好的反映核酸提取及扩增检测过程(与真实病毒模板在基因序列上相近,扩增效率相近)。能更好的反映扩增体系中因抑制物或提取效率不足而产生的“假阴性”。

既可以监测是否采集到足量细胞,又可以监测核酸检测的全流程,包括采样、提取、扩增等环节。
缺点

不能监测是否采到足量的细胞,存在竞争性抑制的可能。

对于所有样本,均无法对检验前过程进行监测。

如果样品类型是口腔液,咽拭子等样品,管家基因的量很低可能导致实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。

理想扩增曲线外源性内标扩增曲线1.jpg内源性内标扩增曲线1.jpg


目前,核酸检测试剂盒基本都已经加入“内标”,主要分为“外源性内标”和“内源性内标”两种。

各个厂家为了减少“假阴性”的发生率,可通过检测内标核酸是否“起线”,判断是否存在“采样、提取、扩增”导致的假阴性。


在实际检测中,我们经常会遇到的“样本内标扩增异常”情况,如何解决曲线异常的问题?

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单链RNA荧光探针C011S50 test239
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