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如何利用CRISPR进行基因敲除(二)如何设计gRNA作者:基因编辑 CRISPR gRNA设计这个教程是系列文章“如何使用 CRISPR 创建基因敲除”中的第2部分,共4部分。 现在我们已经决定了实验中使用的细胞系和 Cas9。是时候开始设计 gRNAs 了!为了敲除你感兴趣的基因的功能,你需要针对靠近 5' 端的连续表达的外显子。这种设计在发生移码突变时有很大可能产生非功能性蛋白。在这里,我们将逐步介绍所有必要的步骤,并讨论在 gRNA 设计中需要考虑的重要因素。我们还将展示如何使用软件设计 gRNAs。 如何设计gRNA?设计gRNA的方法如果要使用CRISPR/Cas9系统对基因组进行编辑,**步也是最重要的一步,就是要设计gRNA。 现在有很多gRNA设计原件,各种软件使用的方法有不同。 下面美格君就用常用的在线gRNA设计网站:http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp 做介绍 进入该网站后,可以见到下面的设计页面: 图1. crispr-era的gRNA设计页面 magigen.com Step1: 指定基因组的操作类型。 在CRISPR-ERA中,可以针对不同的基因组操作类型进行gRNA的设计。下面是具体的操作类型及其对应的gRNA设计规则:
美格小贴士:TSS 是 "Transcription Start Site" 的缩写,中文称为“转录起始位点”。在使用 CRISPR-ERA 工具设计 gRNA 时,了解 TSS 的位置可以帮助研究人员更精确地定位 gRNA 的作用区域,以实现特定的功能。 图2. CRISPR-ERA TSS位置图 Step2: 指定生物种类 在使用 CRISPR-ERA 设计 gRNA 时,您需要指定要进行基因编辑的生物种类(organism)。CRISPR-ERA 支持多种模型生物,包括细菌、酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠和人类。 Step3: 选择具体的基因组 可以选择基因组的名称、TSS的位置、基因组的序列。 gRNA设计结果 输入完成后,点击 CRISPR-ERA search 按钮,可能会得到一批结果,供您选择。 也可以点击 I'm feeling lucky! , 得到系统认为的**选择。 但是出来的sgRNA位置有一些并不总在ATG的下游(图3所示,1,2,6,9,12,16,22几条sgRNA位于ATG的上游)。所以根据位置,对于做基因的敲除(KO)而言,建议选择ATG下游通常100 aa以内范围内的sgRNA来用(比如图3中的3,5,7,10等较下游的);而且,一定要位于CCDS区域内(CCDS是consensus CDS,即公共的CDS区域,是针对很多个转录本[isoforms]定义,图3中路色条框即是。这个很重要!!!)。 图3. CRIPSR-ERA-gRNA设计结果 相关阅读
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