如何利用CRISPR进行基因敲除(三)如何合成gRNA

gRNA合成

本教程是系列文章“如何使用 CRISPR 创建基因敲除”中的第三部分。

为了编辑细胞的基因组，您需要同时将导向 RNA（gRNA）和 RNA 指导的 DNA 切割酶 Cas9 共表达到细胞中。

在本课程之前，美格君和大家一起讨论了如何选择**的 CRISPR/Cas9蛋白 以及如何优化 gRNA 的设计。

在本部分，我们将讨论如何合成将在细胞中表达以创建基因敲除的 gRNA。

图1. gRNA合成方法

本教程讨论了两种合成 gRNA 的方法，并分析了它们各自的优缺点。此外，还提供了每种方法的简要实验方案。下面是对这两种方法的总结：

方法 1：将 gRNA 克隆到质粒中(见图1)

优点

• 易于转染的细胞，如人胚胎肾 (HEK) 细胞，可以很好地吸收超螺旋 DNA，因此以质粒形式递送 gRNA，通常会产生比较高的转染效率。如果您使用易于转染的细胞系，这种方法可能非常适合您。

• 质粒易于扩增并适合长期储存。

缺点

• 对于一些细胞系，如人胚胎干细胞，很难以质粒形式递送 gRNA。研究表明，在某些情况下，如果以 mRNA 形式而不是质粒形式递送 gRNA，则递送效率更高。

提示

• 您可以利用软件工具设计引物，用于使用 BsaI、FokI 或其他 Type IIS 限制性内切酶将 gRNA 克隆到质粒中。

• 有些质粒，如 PX330 和 lentiCRISPRv2，也编码 Cas9，因此您只需要递送一个质粒即可在细胞中共表达 gRNA 和 Cas9。

• 如果您打算将相同的 gRNA 用于其他目的，如激活或干扰内源基因功能，您可以使用一个质粒表达 gRNA，另一个质粒表达 Cas9。

协议

1. 订购寡核苷酸以合成 gRNA。

2. 磷酸化并退火每对寡核苷酸（1小时）。

3. 使用 BbsI (BpiI) 线性质粒并连接寡核苷酸（2小时）。

4. 转化最终产物（1天）。

5. 挑选菌落并验证每个菌落的序列（1天）。

接下来

• 您可以通过脂质体转染或电穿孔递送 PX330。或者，您可以使用 lentiCRISPRv2 作为病毒转导的载体。

方法 2：体外转录 gRNA(见图1)

优点

• 如果细胞难以转染或不分裂，当 gRNA 以 mRNA 形式存在时，递送效率通常比以质粒形式更高。

• RNA 的寿命较短。因此，如果以 mRNA 形式递送 gRNA 和 CRISPR Cas9蛋白，它们会迅速降解，不会被子细胞继承。

缺点

• 如果您以前从未处理过 RNA，您可能需要一些练习才能获得高质量的 RNA。

• 没有筛选方法可用于筛选具有 gRNA 和 Cas9 的细胞。

协议

1. 订购寡核苷酸以合成 gRNA。

2. 体外合成 gRNA 作为 mRNA（6小时）。

3. 纯化并验证 mRNA 的质量（2小时）。

接下来

• mRNA 可以通过脂质体转染或电穿孔递送到细胞中。如果您决定以 mRNA 形式递送 gRNA，可能还要考虑以 mRNA 或蛋白质形式递送 Cas9。在某些细胞中，以 mRNA 或蛋白质形式递送 Cas9 可以提高产生基因敲除的效率。

总结

现在您已经了解了将 gRNA 合成为质粒（方法1）或 mRNA（方法 2）的优缺点。我们总结了一些常见细胞系的研究人员尝试过的 gRNA 形式和递送方法。插入缺失频率（indel 频率）可以作为 gRNA 和 CRISPR/Cas9 递送效率的一个参考指标。

合成 gRNA 之后，就该将 gRNA 和 CRISPR/Cas9 递送到您的细胞中了！

在接下来的文章中，我们将讨论如何将 gRNA 和 Cas9蛋白 递送到细胞中。

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