如何利用CRISPR进行基因敲除(四)质粒转染与递送

图1：使用脂质体转染递送gRNA和Cas9。magigen.com

脂质体带有正电荷，可以与带负电荷的核酸形成复合物。这些复合物被认为带有净正电荷，使得细胞容易摄取质粒。

美格生物小贴士：

• 提高转染效率：使用传代次数较少的细胞，并且细胞密度保持在70%至90%之间。

• 使用最新的高效转染试剂：例如Magigen Lumiere CRISPR/Cas9 Nanoparticles（Cas9/sgRNA NPs）, 可以大幅提高难转染细胞的成功率。

• 优化转染质量：确保核酸质量高。可以通过测量核酸在260nm处的吸光度与280nm处的吸光度之比（A260/A280）来估计核酸的质量。高质量的DNA通常具有约1.8的A260/A280比值；高质量的RNA具有约2.03的A260/A280比值。

• 调整转染参数：如果难以将gRNA和Cas9递送到易于转染的细胞系中，请尝试改变核酸与脂质体的比例、细胞密度以及转染试剂的体积。

• 避免抗生素：转染过程中不要添加抗生素，因为它会导致细胞死亡。

2：电穿孔

电穿孔是一种利用短暂的电脉冲（通常是300至400毫伏，持续不到一毫秒）在细胞膜上产生临时孔洞的技术，使得DNA或RNA能够进入细胞（见图2）。

图2：使用电穿孔递送gRNA和Cas9。

细胞电穿孔的原理

电穿孔通过让细胞暴露于短暂的电脉冲下，扰动细胞膜并形成临时孔洞。这些孔洞是导电的，因此像gRNA和Cas9这样的带电分子可以通过细胞膜并进入细胞内部。

优点

• 快速：使用电穿孔递送DNA或RNA只需要几分钟的时间。一旦优化了电穿孔条件，您可以在短时间内将gRNA和CRISPR Cas9转染到大量的细胞中。

缺点

• 设备需求：您需要自行建造或购买电穿孔装置来进行电穿孔。如果只是偶尔使用，可能难以证明为此付出的努力是值得的。

• 细胞损伤：由于电穿孔涉及向细胞施加高强度电脉冲，这可能导致大量细胞死亡。因此，重要的是要为每种类型的细胞测试并优化电脉冲的强度和持续时间，以最小化过程中的细胞损伤或死亡。

小贴士

• 去除杂质：盐类和蛋白质会降低电穿孔效率，因此重要的是要将核酸纯化并在水或TE缓冲液中溶解。

• 恢复培养：电穿孔后的细胞比较脆弱，所以必须立即向细胞中加入恢复培养基，以维持其健康状态。

电穿孔协议准备工作

1. 准备细胞：收获处于对数生长期的细胞，并将其离心收集。用PBS洗涤细胞两次，然后重悬于电穿孔缓冲液中，使细胞浓度达到1 x 10^7个细胞/mL。

2. 准备核酸：确保核酸已纯化并经过质量检测（如A260/A280比值测试）。

1. 混合细胞与核酸：按照实验设计所需的量将gRNA和Cas9加入到细胞悬液中，轻轻混匀。

2. 电穿孔设置：根据电穿孔仪的说明，设置适当的电压、脉冲长度和其他参数。

3. 电击：将混合好的细胞和核酸转移到电穿孔杯中，并按照设定的参数进行电击。

4. 恢复培养：电击完成后，立即将细胞悬液转移回培养皿中，并加入适量的预热培养基，以帮助细胞恢复。

请根据实际实验条件和具体细胞系调整上述步骤。

细胞电穿孔协议参考：如何进行细胞电穿孔?电穿孔方案实例

细胞电穿孔注意事项

• 在电穿孔前后应监测细胞活力，以评估电穿孔对细胞的影响。

• 根据细胞类型和实验要求，可能需要调整电压和脉冲长度。

• 电穿孔后立即观察细胞，并在必要时更换培养基，以减少细胞应激反应。

3：慢病毒转导

我们还可以使用慢病毒载体递送gRNA和Cas9，慢病毒载体源自一类称为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的逆转录病毒亚类。

首先，我们需要在293T细胞中转染质粒来组装功能性慢病毒颗粒。然后，收获这些慢病毒颗粒，并将它们转导到目标细胞中。当慢病毒颗粒进入细胞后，病毒RNA（包括您的gRNA和Cas9）会被逆转录，导入细胞核，并随机插入到细胞的基因组中（见图3）。您可以从Broad研究所或Trono实验室找到慢病毒转导的协议。

慢病毒转导的优点

• 高效：慢病毒转导可以高效地递送gRNA和Cas9到多种类型的细胞中，包括那些难以转染的细胞，即使是最难转染的细胞系（包括分化神经元），递送效率也很高。

• 稳定性：由于慢病毒可以整合到宿主细胞的基因组中，因此可以长期稳定表达gRNA和CRISPR Cas9。

慢病毒转导的缺点

• 安全性考虑：使用慢病毒转导涉及到潜在的基因组整合风险，可能会导致基因组不稳定或引发其他安全问题。

• 复杂性：与简单的转染方法相比，慢病毒转导的过程更为复杂，需要更多的实验步骤和技术知识。

• 基因组整合风险：病毒基因组随机整合到宿主基因组的位置不可控，可能会影响细胞的重要功能。如果您担心这个问题，可以考虑使用腺相关病毒（AAV）。

• 劳动密集型：生产并转导慢病毒颗粒的过程繁琐，大约需要两周的时间。

美格小贴士

• 高产量：应在转染前24小时内准备293T细胞，以实现高效的病毒生产。

• 分装保存：生成慢病毒颗粒后，将病毒库存分成小份保存，这样就不必经常冻融。

• 细胞健康：如果慢病毒转导后细胞看起来不健康，可以尝试减少使用的慢病毒颗粒量或在转导后4小时更换生长培养基。

• 优化转导：优化包装细胞的转染条件和培养条件，以获得更高的病毒滴度。

• 选择性标记：使用含有抗性标记的载体可以帮助筛选转导成功的细胞。

如果您需要更详细的指导或有关于特定细胞系的问题，请随时告诉我。

图3：使用慢病毒转导递送gRNA和Cas9。

慢病毒颗粒通常通过将三种质粒转染到293T细胞中来生产：

(1) 假型质粒；

(2) 克隆质粒；

(3) 包装质粒。假型质粒编码包膜蛋白（紫色）；克隆质粒包含ψ包装序列、您的gRNA和Cas9；包装质粒含有衣壳蛋白（棕色）和逆转录酶（灰色）。293T细胞表达这些质粒并产生慢病毒颗粒。收获慢病毒颗粒后，可以将其转导到目标细胞中。一旦进入细胞内，逆转录酶（灰色点）将病毒RNA基因组逆转录成病毒DNA基因组。病毒DNA基因组随后被导入细胞核并随机整合到细胞的基因组中。您的细胞将在慢病毒转导后24-48小时内稳定表达gRNA和Cas9。

下一步是什么？

在上一篇文章中，我们讨论了在一些最常见的细胞系中哪种方法能提供**的递送效率。在本文中，我们解释了如何实施递送方法。在下一篇文章中，我们将讨论可用于检测细胞中插入和缺失（indel）的功能性实验。这些实验将帮助您验证CRISPR-Cas9系统的基因编辑效果。

敬请期待！

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