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如何利用CRISPR进行基因敲除(四)质粒转染与递送作者:基因编辑 质粒转染与递送通过前面的介绍,我们已经设计了向导RNA(gRNA),并根据所使用的细胞系合成了gRNA和CRISPR/Cas9蛋白。 接下来的问题是如何将它们递送到细胞中?在上一篇文章中,我们提供了一个表格来帮助您根据所用的细胞系选择合适的递送方法。 在这篇文章中,我们将讨论三种标准的递送方法,并分析它们各自的优缺点。 对于每种选项,我们也会提供一些进一步的资源,包括实验步骤和质粒图谱。 1:脂质体转染脂质体转染是一种基于脂质的方法,用于将DNA或RNA构建体递送到细胞内(见图1)。 操作过程很简单: 将gRNA和Cas9与脂质囊泡(脂质体)混合以形成脂质体-gRNA/Cas9复合物,然后直接将这些复合物加入到您的细胞培养基中。经过大约24小时的孵育后,细胞开始表达gRNA和Cas9。
脂质体转染的缺点:
以下是将gRNA和Cas9作为质粒或RNA转染到细胞中的协议, 仅供参考: 质粒转染协议 RNA转染协议 请注意,为了确保实验的成功,您需要根据具体的实验需求和所用的细胞系调整转染条件。 图1:使用脂质体转染递送gRNA和Cas9。magigen.com 脂质体带有正电荷,可以与带负电荷的核酸形成复合物。这些复合物被认为带有净正电荷,使得细胞容易摄取质粒。 美格生物小贴士:
2:电穿孔电穿孔是一种利用短暂的电脉冲(通常是300至400毫伏,持续不到一毫秒)在细胞膜上产生临时孔洞的技术,使得DNA或RNA能够进入细胞(见图2)。 图2:使用电穿孔递送gRNA和Cas9。 细胞电穿孔的原理电穿孔通过让细胞暴露于短暂的电脉冲下,扰动细胞膜并形成临时孔洞。这些孔洞是导电的,因此像gRNA和Cas9这样的带电分子可以通过细胞膜并进入细胞内部。 优点
缺点
小贴士
电穿孔协议准备工作
请根据实际实验条件和具体细胞系调整上述步骤。 细胞电穿孔协议参考:如何进行细胞电穿孔?电穿孔方案实例 细胞电穿孔注意事项
3:慢病毒转导我们还可以使用慢病毒载体递送gRNA和Cas9,慢病毒载体源自一类称为人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的逆转录病毒亚类。 首先,我们需要在293T细胞中转染质粒来组装功能性慢病毒颗粒。然后,收获这些慢病毒颗粒,并将它们转导到目标细胞中。当慢病毒颗粒进入细胞后,病毒RNA(包括您的gRNA和Cas9)会被逆转录,导入细胞核,并随机插入到细胞的基因组中(见图3)。您可以从Broad研究所或Trono实验室找到慢病毒转导的协议。 慢病毒转导的优点
慢病毒转导的缺点
美格小贴士
如果您需要更详细的指导或有关于特定细胞系的问题,请随时告诉我。 图3:使用慢病毒转导递送gRNA和Cas9。 慢病毒颗粒通常通过将三种质粒转染到293T细胞中来生产: (1) 假型质粒; (2) 克隆质粒; (3) 包装质粒。假型质粒编码包膜蛋白(紫色);克隆质粒包含ψ包装序列、您的gRNA和Cas9;包装质粒含有衣壳蛋白(棕色)和逆转录酶(灰色)。293T细胞表达这些质粒并产生慢病毒颗粒。收获慢病毒颗粒后,可以将其转导到目标细胞中。一旦进入细胞内,逆转录酶(灰色点)将病毒RNA基因组逆转录成病毒DNA基因组。病毒DNA基因组随后被导入细胞核并随机整合到细胞的基因组中。您的细胞将在慢病毒转导后24-48小时内稳定表达gRNA和Cas9。 下一步是什么?在上一篇文章中,我们讨论了在一些最常见的细胞系中哪种方法能提供**的递送效率。在本文中,我们解释了如何实施递送方法。在下一篇文章中,我们将讨论可用于检测细胞中插入和缺失(indel)的功能性实验。这些实验将帮助您验证CRISPR-Cas9系统的基因编辑效果。 敬请期待! 相关阅读
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