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LAMP恒温扩增技术在水产养殖病毒快速检测中的应用作者:LAMP扩增 LAMP恒温扩增技术水产养殖病毒快速检测随着水产养殖业的蓬勃发展,水产动物病害发生的频率和范围也逐渐增大,给水产养殖业带来巨大的经济损失。发展快速、灵敏、准确的病原检测技术在水产动物疫病的早期诊断以及水产品卫生质量监督检验等方面都具有重要的意义。免疫荧光技术(FAT)、酶联免疫吸附(ELISA)分子检测技术(PCR、RFLP、AFLP、RAPD等)已经被用来检测各种水产病原。近年来,一种成熟的恒温核酸扩增方法--LAMP恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplifica-tion),即环介导等温扩增法已被开发应用。 LAMP和RT-LAMP恒温扩增技术在水产动物病原检测中的应用1. 用LAMP扩增技术检测细菌水产动物病原菌的快速检测一般采用酶联免疫吸附试验(ELISA,其中, 以间接ELISA和双抗体ELISA更常用)PCR技术、单克隆抗体技术、核酸杂交技术等。 现在,市场上已有企业用LAMP扩增测试方法检测人类、水产动物和水产养殖环境中病原菌。2003年,MARUYAMA等首次采用LAMP方法快速检测海岸环境中的大肠杆菌,取得了理想的结果。而首次用LAMP法检测的水产动物病原菌是迟钝爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)。2004年,SAVAN等根据迟钝爱德华氏菌的溶血素(haemolysin)基因序列设计了4条引物,成功地扩增了迟钝爱德华氏菌的溶血素基因,检测出从日本鳗鲡(Anguillajaponica)等4种水产动物和养殖水体中分离的5株迟钝爱德华氏菌,但是,检测非迟钝爱德华氏菌病原菌,都没有产生特异性扩增,从而证明LAMP法检测迟钝爱德华氏菌具有很强的特异性。将LAMP法和PCR方法的灵敏性进行比较,结果发现LAMP法对迟钝爱德华氏菌的最低检测极限为10CFU/mL,比PCR法灵敏100倍。用LAMP法检测正常的和受迟钝爱德华氏菌感染的褐牙鲆(Paralichthys olivaceus),仅从受感染鱼的脾和肾中提取的 DNA作为模板能产生特异性扩增,并且也检测了养殖水体中的迟钝爱德华氏菌,其最低的检测浓度LoD为3.8x102 CFU/mL。由鮰鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)引起的斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肠败血症(ESC),是对斑点叉尾鮰养殖业危害较大的传染病,在世界动物卫生组织《水生动物疾病诊断手册》第三版(2000年)中被列为重要鱼病。因此,发展快速、灵敏、准确的鮰鱼爱德华氏菌检测技术对于ESC诊断、监测以及水产品卫生质量监督检验等都具有重要的意义。 YEH等设计了4条LAMP引物,反应条件优化为65℃, 反应60min,检测了6株不同来源的鮰鱼爱德华氏菌都为阳性反应,而同时检测的12株其它菌株,则为阴性。LAMP法的最低检测浓度LoD为20CFU/mL,比实时PCR法更加灵敏。从人工感染的斑点叉尾鮰的脑中提取的DNA作为模板,产生了特异性扩增,证明LAMP扩增法能在实际诊断中简单灵敏的检测出鮰鱼爱德华氏菌。 ITANO等用LAMP法检测诺卡氏菌(Nocardia seriolae)病,最低检测极限LoD为103 CFU/mL,比PCR法灵敏10倍。而且当从被感染鱼的脾中提取DNA作 为反应模板,LAMP法更远优于PCR法。 YEH等采用LAMP法快速检测柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)通过16S rRNA基因序列设计2对引物,60℃, 反应60min, 产物通过琼脂糖电泳检测。检测了17株菌,结果只有5株柱状黄杆菌产生扩增。从人工浸泡感染的斑点叉尾鮰的皮肤、鳃、头、肾中提取 DNA作为LAMP法的模板,都产生了特异性扩增,而正常鱼中都没有产生扩增反应。 2. 用RT-LAMP扩增技术检测病毒水产动物病毒的检测和诊断比较复杂,常用的方法有组织病理切片、病毒的分离培养、Western blot、ELISA 和单克隆抗体技术等,但是这些方法繁琐、费时、昂贵。PCR方法的出现虽然简化了操作,提高了灵敏度,节省了时间,但是它对试验仪器要求较高,限制了它在实际检测中的应用。LAMP恒温扩增法操作简单,仪器设备只需要一个水浴锅即可,总费用较低、耗时短,例如, Magigen RT-LAMP Kit, 30分钟内即可完成扩增反应; 反应结果可以通过便宜的仪器读取,反应产物甚至可以直接通过肉眼观察,在水产动物病毒的检测上具有很好的发展前景。 2.1 用LAMP扩增技术检测DNA病毒 KONO等采用LAMP恒温扩增方法检测了日本对虾(Marsupenaeus japonicus)的白斑综合征病毒(white spot syndrome vinus,WSSV),反应条件优化为60℃,反应60min。用LAMP等温扩增法检测病毒DNA的极限可达10 fg, 而采用nested-PCR法的检测极限则为100 fg。2004年,GUNIMALADEVI等根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)胸苷激酶(thymidine kinase,TK)的基因序列设计引物,采用LAMP扩增法检测疱疹病毒,检测的灵敏度和PCR方法相似,但是 LAMP扩增方法所需的时间仅为60~90min左右,而PCR一般则需3-4H。 SOLIMAN和EL-MATBOULI也采用此法检测了锦鲤疱疹病毒(KHV),60℃反应60min,得到了相似的结果,产物通过SYBR Green I染色后,不需特殊仪器,可直接通过肉眼观察,整个反应过程只需90min左右。 CAIPANG等用LAMP扩增方法检测虹彩病毒(red seabream iridovirus,RSIV),由于核酸大量合成时,从 dNTP析出的焦磷酸盐和镁离子结合生成焦磷酸镁白色沉淀,故反应产物可以直接通过肉眼观察,由于反应产生的核酸量和相对应的混浊度有一定的相关性,可据此推算被感染真鲷(Pagrus major)中RSIV的数量。LAMP扩增法检测RSIV的灵敏度是PCR法的10倍。 SUN等采用LAMP等温扩增法检测了南美蓝对虾(Penaeus stylirostris)传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV),反应条件优化为64℃反应60min,反应产物可以通过琼脂糖电泳检测,也可以根据反应产物的浊度或SYBR Green l染色后肉眼观察,LAMP扩增法检测的灵敏度比 PCR 法高100倍。 2.2 用RT-LAMP扩增技术检测RNA病毒 应用反转录PCR(RT-PCR)诊断RNA病毒已经被广泛的应用,然而RT-PCR检测成本较高。 由于每一个样本都要经过反转录,反应时间较长,反应效率较低。随着LAMP扩增技术的发展,反转录LAMP扩增技术 (RT-LAMP)也被广泛应用。 国际市场上,RT-LAMP已经被用来检测一些水产动物病毒。 GUNIMALADEVI等采用RTL-AMP法检测感染虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV),以G-蛋白的基因序列设计引物,RT-LAMP和LAMP的反应优化为64℃反应60min,并且将RT-LAMP、LAMP和nested-PCR进行比较。在研究中发现LAMP和RT-LAMP检测的最低限度相同,灵敏度都比nested-PCR高10倍。尽管目前Real-time PCR方法是检测IHNV很成熟灵敏的方法,但是由于它所需的仪器昂贵,因此RT-LAMP可替代实时PCR成为一种常规的诊断方法。 PILLAI等采用RT-LAMP扩增方法检测了引起罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)白尾病的诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)和小病毒颗粒(extra small virus,XSV),比较了RT-LAMP,增加了Loop引物的RT-LAPM和RT-PCR的灵敏度,结果发现RT-LAMP比PCR灵敏10倍,而增加了Loop引物的RT-LAPM比RT-PCR灵敏10000倍。SOLIMAN和EL-MATBOULI 采用此方法快速检测病毒性出血性败血症病毒(viral haemorhagi septicaemia virus,VHSV), 利用 G-蛋白的基因序列设计引物,优化反应条件为63℃反应60min,反应产物通过琼脂糖电泳检测,或SYBR Green I 染色肉眼观察,RT-LAMP扩增法检测的灵敏度和RT-PCR相同: 但是RT-LAMP只需要1h就可以完成病毒的检测,而RT-PCR则需要4~5h,而且,用SYBR Green I染色比琼脂糖电泳检测所需时间更短。MEKATA等采用RT-LAMP法检测了黄头病毒(yellow head virus,YHV),反应条件优化为65℃反60min,从被感染的斑节对虾(Penaeus monodon)的鳃和心脏中快速灵敏的检测出黄头病毒,并且同时检测健康的虾、桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus,TSV)、白斑综合征病毒(WSSV),均没有产生特异性扩增,证明了此法检测 YHV 具有很强的特异性。 3. 用LAMP扩增技术检测寄生虫LAMP方法也可以用来检测水产动物中的寄生虫感染。增生性肾脏病(Proliferative kidney disease,PKD)是由一种孢子虫纲的寄生虫(Tetracapsuloides bryosalmonae)感染而引起的,这种寄生虫寄生于鱼的肾上,会引起严重的炎症, 并破坏造血组织,鱼会由于贫血而无活力直至死亡。除了一些传统的对肾脏组织染色外,一些现代的方法比如以小亚单位核糖体核糖核酸基因(SSUrDNA)目的基因设计的PCR方法、原位杂交、单克隆抗体(MAB)技术等也用来检测此病。 2005年,EL-MATBOULI和SOLIMAN用LAMP扩增方法快速检测了虹鳟的PKD疾病,而且将LAMP方法和常规的PCR方法进行比较。他们根据目的基因 SSUrDNA设计了4条引物,并且加入了Loop引物来加速LAMP扩增反应,整个反应过程在1h内完成,LAMP反应比PCR反应的灵敏度高100倍。并且EL-MATBOULI和SOLIMAN也用LAMP法快速检测了寄生鱼和寡毛类动物体上的黏液孢子虫(Myxobolus cerebralis),检测的灵敏度和PCR相似,但是,LAMP法需要的时间更短,而且只需要一个水浴锅用来扩增,因此,更加适用于实际诊断。 4. LAMP检测技术在水产养殖业的商业化应用前面所提到的一些LAMP扩增方法是十几年前的实验室验证,由于LAMP的引物设计比较复杂,在实际的水产养殖应用场景中,对检测灵敏度的要求更高,LAMP扩增技术遇到了比较大的应用转化困难。而随着PCR技术的不断改进,目前PCR技术已经成为了检测的金标准。 但是,近几年LAMP扩增技术也在进步。 2023年,国际上已经有比较成熟的商用LAMP试剂解决方案,有些企业已经利用Magigen RT-LAMP Kit试剂开发出检测鱼虾病毒的商业化产品,灵敏度很高,不低于PCR的金标准,时间却大大缩短,最长不超过30min,最快不到10min,就可以获得检测结果,检测设备非常便宜,非常适合水产养殖户随时随地现场检测,及时发现病情,及早处理。
LAMP扩增法已经成为一种成熟的恒温核酸扩增方法,它具有等温、高效灵敏、特异性强等优点。虽然其反应原理、引物设计比较复杂。但随着LAMP检测试剂套件的推出,产品开发的难度已经大大降低。企业可以在短时间内开发出低成本、高灵敏度的POC水产养殖检测产品,满足水产养殖业的庞大需求。 扩展阅读
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