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用Cas13进行大规模多重核酸检测作者：Simon来源：Nature 广州美格生物提供全系列的CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条，用于基因编辑、快速检测。想了解详情，请点击：CRISPR Cas蛋白、恒温扩增试剂、逆转录酶、侧向层析试纸条如何利用CRISPR Cas蛋白开发快速检测产品系列2为了控制和防止流行性疾病的大流行，需要快速、简捷的技术手段。美格生物专注于快速分子诊断和分子检测的研究，并与同行保持交流、合作。最近美国科学家Pardis C. Sabeti团队的研究成果，为行业提供了有益的思路。 研究摘要 Pardis C. Sabeti团队开发了用于核酸多重评估的组合阵列反应CARMEN，Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids ，这是一种可扩展的多重病原体检测平台，能够扩展以测试许多样品、同时测试许多病原体。 在CARMEN平台中，含有基于CRISPR的核酸检测试剂的纳米液滴，在微孔阵列中自行组织以与扩增样品的液滴配对，在复制中，针对每个CRISPR RNA（crRNA）测试每个样品。 使用CARMEN-Cas13多重检测方法，可同时将所有169种人类相关病毒与至少10种已发表的基因组序列区分开来，并迅速加入额外的crRNA来检测2020年COVID-19大流行的致病因子。CARMEN-Cas13进一步实现了甲型流感病毒株的全面亚型分型和数十种HIV耐药突变的多重鉴定。CARMEN固有的多路复用和吞吐量功能使其具有可扩展性，因为小型化可将每次测试的试剂成本降低300倍以上。可扩展的、高度多路复用的、基于CRISPR的核酸检测将诊断和监测工作从高优先级样品的靶向测试转移到大样品组的全面测试，极大地使患者和公共健康受益。 阐述 传染病是对人类健康和全球安全的一些**威胁，但绝大多数致病微生物没有广泛可用的分子检测手段。在感染人类的病毒物种中，576个已被测序，其中169个在2018年10月之前至少有10个已发表的基因组，只有39个具有FDA批准的诊断。 虽然有些实验室开发的测试方法已经开发用于在特定设备，对不同病原体进行临床测试，但这些测试可能需要很长的周转时间，并且很少可以多路复用。 通过测序或微阵列杂交进行的全面疾病检测提供了关于病原体基因型和进化的详细信息，但由于样品制备的成本和后勤需求，难以大规模实施。快速、低成本的检测方法，例如基于CRISPR的方法，基于抗原的测试，PCR或等温扩增（RDA、RPA、LAMP等），在给定的反应中仅检测一种或少量病原体。结合这些方法的优势，理想的诊断和检测技术将是高度多路复用，并且可以轻松扩展到数百个样本中。 微孔阵列系统CARMEN利用小型化和自行组织来进行全面的组合实验，实现高度多重的核酸检测。（图1，扩展数据图1）
图1 在该系统中，用户准备采集输入液滴乳液，液滴自行输入到阵列的孔中，反复创建所有可能的成对组合，无需额外的人工作或仪器操作。 我们设想基于CRISPR的核酸检测可以与微孔阵列系统集成，以并行方式为许多分析物测试大量的扩增样品。 CARMEN-Cas13的输入是通过PCR或重组酶聚合酶扩增等温扩增和Cas13蛋白检测混合物扩增的样品，其中含有Cas13，序列特异性CRISPR RNA（crRNA）和切割报告基因（扩展数据图1）。
扩展数据图1. 分子和宏观尺度的CARMEN工作流程 每个扩增的样品或检测混合物在常规微量滴定板中制备，并与作为光学标识符的独特的溶液荧光颜色代码组合。将每种颜色编码的溶液在含氟油中乳化以产生1-nl液滴。 一旦乳化，将来自所有样品和检测混合物的液滴合并到单个管中，并在一个移液步骤中加载到由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模制的微孔阵列芯片中（图1，扩展数据图。1,2）。
扩展数据图2. CARMEN中加载器和芯片功能的详细示意图。 阵列中的每个微孔随机容纳来自池的两个液滴，从而自发地形成液滴输入的所有成对组合，并且阵列针对玻璃基板密封以物理隔离每个微孔。通过使用荧光显微镜鉴定液滴的颜色代码来确定每个微孔的含量。暴露在电场中会合并每个微阱中的液滴对，同时引发所有检测反应。荧光显微镜用于监测每个检测反应（图1，扩展数据图。1，2）。 CARMEN–Cas13敏感、特异且统计可靠。 CARMEN-Cas13可以检测到渺摩尔级的Zika病毒序列。 利用CRISPR cas13蛋白的侧向切割活性来匹配特异性高灵敏度酶促解锁SHERLOCK和基于PCR的测试灵敏度。 此外，CARMEN-Cas13受益于SHERLOCK的特异性；通过Cas13-crRNA结合和识别实现序列特异性鉴定，减轻了对其他核酸检测方法中常见的脱靶扩增的担忧。每个CARMEN-Cas13分析结合M个样品和N个crRNA进行M×N测试，每个测试包含一组crRNA-样品液滴对重复。液滴级CARMEN-Cas13反应具有高度可重复性，每个标准容量芯片可进行1000次测试。 对数百种微生物病原体的多个样品进行准确测试需要比现有多路复用检测系统更高的通量。为了实现具有高样品通量的高度多重检测，我们使用4种市售小分子荧光团的比例开发了一组1050种基于溶液的颜色代码。 使用1050种颜色代码，99.5%的液滴在允许的过滤后，保留下94%液滴，可以正确分类 。 为了匹配我们的1050个颜色代码启用的吞吐量，我们设计了一个大容量芯片（mChip），每个芯片允许超过4500个统计复制测试。与标准多孔板SHERLOCK测试相比，mChip可将每次测试的试剂成本降低300倍以上，同时减少移液步骤和周转时间。 我们设计了一种CARMEN–Cas13分析方法，可以选择性地同时测试所有169种人类相关病毒（HV）的数十个样品，其中至少有10个可用的已公开基因组（截至2018年10月24日）。 我们将ADAPT方法应用于我们的HV组合的已发表病毒基因组，为PCR引物库选择扩增子，用引物优化引物序列。 ADAPT接受排列成组的序列集合（例如，物种内的所有已知序列）。对于每个组，ADAPT搜索对组内序列敏感的**crRNA组（即，它们检测所需的序列部分），并且不太可能检测其他组中的序列。我们使用ADAPT为每个物种设计一小组crRNA序列，以便考虑到NCBI GenBank上的基因组多样性，每个crRNA集在其目标物种内提供高覆盖率（超过90%的检测序列），并对其他物种具有高选择性。 研究人员将HV组合设计为核酸检测分析的模块化主集，最终用户可以针对不同的应用进行定制。 利用CARMEN–Cas13的大规模多路复用功能，我们测试了整个HV 组合并展示了其性能。
图2. 用CARMEN–Cas13全面鉴定HV 研究人员从设计中的每个物种中选择**的crRNA（共169个），并根据每个物种的合成一致序列对每个物种进行评估，每个物种使用其相应的引物池（184个PCR产物，包括对照；图2b）进行扩增，总共30个，在8 mChips上进行了912次试验。 测试进行了两轮测试，第二轮改进了11个物种（6.5%）的设计。在未改变设计的两轮试验之间，达到97.2%的一致性，表明单个crRNAs可以在不改变其他分析性能的情况下得到改进。 在第二轮中，167例crRNAs中有157例（94%）信号高于阈值（高于背景6×s.d.），按目标可选，在所有167个crRNA模型评估指标AUC（area under the curve）中位数为0.997。此外，即使合成靶被所有引物池放大，也没有观察到广泛的交叉反应。 随着新冠病毒COVID-19的爆发，团队迅速将新型冠状病毒SARS-CoV-2测试纳入从HV获取的冠状病毒组合中，展示了该模块适应现实挑战的能力（图2d）。 使用单个mChip，400多个样本可以与冠状病毒组合并行测试。 为了在更具挑战性的环境中测试CARMEN，研究人员对来自各种确诊感染患者的58份血浆、血清、咽喉和鼻腔拭子样本进行了HV组合评估。 每个临床样本作为未知样本处理，并使用所有15个引物池进行扩增（图2e）。为了增加测试吞吐量，PCR产物随后被集中在三个一组的集合中（每个患者样本有五个“元池metapools”），并使用来自HV组合的crRNAs进行测试。 作为金标准的比较读数，用下一代测序NGS在每个样本上的读数超过200万次；在11268个可由两种方法解释的测试中，11236个（99.7%）是一致的（图2f）。我们发现CARMEN在大多数样本中发现已知感染，其中NGS检测到这些病毒的任何序列，包括CARMEN和NGS在登革热和寨卡试验中的完全一致性（图2g）。 可以根据检测序列的能力对CARMEN和NGS进行比较，揭示了在所测试的crRNA靶点中，CARMEN在每个位点上比NGS更敏感（图2h）。 CARMEN的总体检测灵敏度，特别是对不同病毒的敏感性，可以通过添加crRNA来覆盖额外的基因座, 和/或具有序列多样性的基因座来提高，正如我们在甲型流感亚型中所证明的那样。值得注意的是，靶位点的序列异质性是所有靶向核酸检测方法面临的挑战，可以通过crRNA多路复用来克服这一问题。最后，在我们对患者样本的测试过程中，CARMEN和NGS都发现了样本中先前未知的特定病毒（图2i）。 因此，虽然很明显HV组合可用于同时监测许多病毒，但必须认识到，将HV组合的结果与患者症状和医学专业知识相结合，对于在临床环境中有效使用CARMEN检测至关重要。 利用Cas13检测的特异性，CARMEN–Cas13系统可以同时鉴别所有与流行病学相关的甲型流感血清型。 病毒种类（如甲型流感）的多样性给检测带来了巨大的挑战；分析必须正确识别一组菌株中的许多不同序列，同时对该组保持选择性。为了区分甲型流感病毒的血凝素（H）和神经氨酸酶（N）亚型H1-H16和N1-N9，研究人员设计了H和N扩增子，这些扩增子具有足够的保守性，能够用两个平行的引物组进行扩增，并用于设计特定的crRNAs组来识别亚型。 我们使用来自H1-H16和N1-N9的合成一致序列测试每组的**crRNA，并成功地识别出这些亚型。研究人员进一步使用合成序列测试了N亚型分析，这些合成序列共同覆盖了N1-N9亚型中90%以上的序列多样性，并在35个序列中确定了32个（91.4%）。 最后，研究人员用2018-2019年流感季节感染的20个人类的咽喉和鼻腔拭子验证了亚型分析，并成功地将所有这些感染亚型，与美国疾病预防控制中心和团队实验室进行的NGS的反转录定量PCR结果100%一致。在这些结果的基础上，分析有可能识别出H1-H16和N1-N9亚型的144种组合。 Cas13蛋白突出的特异性也使CARMEN–Cas13能够识别临床上相关的多重病毒突变，例如产生耐药性的突变。为了证明这一点，研究人员设计了一对引物，利用HIV逆转录RT酶编码序列和一组crRNA来识别六种常见于抗病毒治疗的原始患者群体中的耐药突变。 针对合成靶点测试设计，并行地识别出所有六个突变。研究人员在22份来自HIV患者的样本上验证了逆转录RT酶DRM分析，其中一些样本包含多个突变，并证明与样本提供者的Sanger测序结果90%一致，与CARMEN测试同时执行的NGS保持86%一致。 在某些情况下，NGS揭示了引物和crRNA设计以及患者序列之间的差异，因为研究人员设计了针对HIV B亚型的检测方法，但使用后来从G亚型HIV感染者身上获得的样本进行了测试。 用与设计相关的多达三个不匹配的序列进行过滤，增加了CARMEN和Sanger测序之间的一致性（93%），以及CARMEN和NGS之间的一致性（93%）。 为了证明该方法的普遍性，团队开发了一个CARMEN组合来测试21个临床相关的HIV整合酶DRM,，HIV整合酶是**线HIV治疗的靶点，并在一组9个复合合成靶点中识别出所有这些突变。 该研究已经证明了CARMEN–Cas13在物种、株系和单核苷酸多态性（SNP）水平上区分病毒序列的广泛用途，以及快速开发和验证高度多重化检测面板的能力。更普遍地说，CARMEN–Cas13蛋白系统通过增加吞吐量、减少每次测试的试剂和样本消耗，并在更大的动态范围内实现检测，从而增强了基于CRISPR的核酸检测技术。CARMEN的灵活性和高通量可以适应在现有CARMEN分析中添加和快速优化新的扩增引物或crRNA，以便于检测新发现的病原体序列，正如在SARS-CoV-2中所证明的那样。此外，在病原体检测、发现和进化的大背景下，CARMEN和NGS相辅相成。CARMEN可以快速识别感染样本，以便进一步测序以跟踪病毒的持续进化，而新确定的序列可以为改进的基于CRISPR的诊断方法的设计提供依据。 未来，Sabeti团队设想部署特定区域和疫情的检测组合，对来自选定人群的数千份样本进行检测，包括动物媒介、动物蓄水池或出现症状的患者。在临床护理中采用此类组合，需要专家对结果进行仔细的背景解释。 CARMEN实现了基于CRISPR的大规模诊断，这是实现常规、全面疾病监测以改善患者护理和公共卫生的关键一步。 美格生物在CRISPR快速检测技术方面有着丰富的经验，可以为合作伙伴提供强力的支持。 方法 没有使用统计学方法来预先确定样本量。实验不是随机的。在实验和结果评估过程中，研究者没有盲目分配。 参考文献 Massively multiplexed nucleic acid detection with Cas13 Cheri M. Ackerman, Cameron Myhrvold, Sri Gowtham Thakku, Catherine A. Freije, Hayden C. Metsky, David K. Yang, Simon H. Ye, Chloe K. Boehm, Tinna-Sólveig F. Kosoko-Thoroddsen, Jared Kehe, Tien G. Nguyen, Amber Carter, Anthony Kulesa, John R. Barnes, Vivien G. Dugan, Deborah T. Hung, Paul C. Blainey & Pardis C. Sabeti 相关阅读 CRISPR Cas13a结合恒温扩增技术进行病毒检测与实战验证 脑洞大开，用CRISPR CAS13A喷雾治疗流感和新冠病毒 从CRISPR Cas13开始: Crispr Cas13蛋白的作用与用途 RNA targeting with CRISPR Cas13a 基于CRISPR Cas13a的快速、简易核酸检测CREST |
