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CRISPR/Cas12i系统的结构和工作机理详解

作者:Heng Zhang

CRISPR基因编辑技术

CRISPR/Cas12i系统

CRISPR-Cas相关的基因编辑工具以其高效、简便等优势成为生命医学领域最前沿的技术之一。

Type V CRISPR-Cas12系统是一类种类丰富的防御系统,目前已经有多达11种亚型(Cas12a-k)被鉴定。

当前多个CRISPR Cas12亚型(Cas12a/Cpf1、Cas12b、Cas12e/CasX及Cas12j/CasΦ)都可用于哺乳动物基因组编辑,显示出Cas12系统巨大的应用潜力。大部分Cas12亚型主要切割dsDNA,而Cas12i亚型主要切割dsDNA中的非互补链,形成单链切口(nick),其在基因编辑应用中可能具有较高的特异性。

Cas12i系统自身就可以完成对pre-crRNA的成熟,具有多重基因编辑的潜力;相对于CRISPR Cas9和Cas12a,Cas12i分子量较小,体内递送具有一定优势。CRISPR Cas12i亚型在基因编辑应用上具有很大的潜力。


2020年9月7日,来自美国普渡大学的畅磊福研究团队利用冷冻电镜技术解析了多种不同状态的Cas12i与crRNA和dsDNA底物复合物的结构。

Cas12i–crRNA–dsDNA的结构

为了揭示Cas12i识别靶点的机制,研究人员通过将催化失活的Cas12i,与含有5′-TTN-3′PAM序列的60 nt 前体crRNA(pre-crRNA)、36 nt靶标DNA链和10 nt非靶DNA链孵育,组装了Cas12i–crRNA-DNA三元复合物,然后使用冷冻电镜Cryo-EM确定三元复合体的结构。

通过Cas12i的RNase活性切割5′端的一个片段,将前体crRNA加工成成熟的crRNA。

Cas12i的整体结构显示出一种双叶结构,包括由REC1、REC2和PAM相互作用(PI)结构域组成的REC和由RuvC、Wedge(WED)和NUC结构域构成的NUC(图1a–g)。

crRNA在3′端包含一个28 nt间隔区衍生的引导片段(位置1-28),在5′端,重复序列形成茎环结构(图1h,i)。

干环被REC2和WED结构域夹在中间,在干环之前有一个扩展的富含U的序列,由WED结构区保持(图1c,e)。

crRNA的间隔区衍生的引导片段和靶DNA链的原间隔区衍生序列形成28bp的异源双链,其穿过由WED、REC1、REC2和RuvC结构域包围的中心通道(图1d–g)。

靶链(TS)碱基的3′端与NTS配对,形成插入到由PI、WED和REC1结构域产生的凹槽中的PAM双链体(图1d)。

尽管序列同一性(5.5%)和相似性(14.2%)较低,但DALI搜索显示Cas12b是与Cas12i最接近的结构同源物。观察到它们的整体结构存在显著差异。

首先,在Cas12i的WED结构域中存在一个额外的螺旋(α1),以容纳crRNA的扩展的富含U的序列。

第二,Cas12b的tracrRNA干环区域被Cas12i中的两个额外的螺旋(α3和α4)取代,这两个螺旋参与crRNA的干环的稳定。

此外,Cas12i的REC1结构域比Cas12b长约20Å,其特征是具有长的反平行螺旋对α16和α17,其保持crRNA-靶DNA异源双链体。

相对于Cas12b,Cas12i的PI结构域包含三个额外的螺旋(α8、α9和α12),而Cas12i的RuvC和Nuc结构域比Cas12b的更紧密。


结合结构指导的蛋白质突变和体外切割活性实验,研究团队对PAM识别、dsDNA底物与crRNA配对进行了验证,同时鉴定了Cas12i切割pre-crRNA与底物dsDNA的酶活位点。

值得注意的是,该研究团队发现Cas12i识别28 bp 底物dsDNA,并通过生化实验揭示28 bp的底物dsDNA会显著提高Cas12i切割dsDNA中互补核酸链的能力,即造成底物dsDNA双链切割。

目前, 用于基因编辑的Cas9、Cas12a、Cas12b和Cas12e等系统识别20 bp的底物dsDNA,具有一定程度的脱靶效应。因此Cas12i具有发展成保真度较高的基因编辑系统的潜力。利用三维结构分类,该研究团队还发现了Cas12i识别14-15bp 底物dsDNA的中间状态,结合生化实验发现14-15 bp的底物dsDNA就可以完全激活Cas12i的切口酶(nickase)活性,但是却无法切割dsDNA中互补核酸链,提示Cas12i工作机制很可能是两步激活:14-15bp底物dsDNA与crRNA配对后激活Cas12i切割非互补链,16-28 bp底物dsDNA与crRNA配对后激活Cas12i切割互补链。


CRISPR-CAS12I-crRNA-DNA.jpg

图1. Cas12i-crRNA-dsDNA复合体的2.9Å冷冻电镜结构

a: Cas12i的结构域组织, crRNA、TS、NTS和底物DNA分别呈橙色、品红色、青色和天蓝色。

b: 冷冻电镜图,Cas12i–crRNA–dsDNA三元复合物视图,Cas12i的每个结构域的颜色编码如a所示。PAM序列呈红色。

c: Cas12i–crRNA–dsDNA三元复合物视图,已旋转180°。

d, e: Cas12i–crRNA–dsDNA三元复合物的原子模型,分别对应图b和图c两个视图。

f, g: Cas12i与棒状呈递中的crRNA和DNA的表面电势(对应于b和c中的图谱)。

h: crRNA和靶DNA的示意图。

i: Cas12i–crRNA–dsDNA三元复合物中crRNA和靶DNA的结构。

Pre-crRNA处理

与CRISPR-Cas12a类似,Cas12i能够处理其pre-crRNA。

为了了解Cas12i对pre-crRNA加工的机制,研究人员分析了crRNA 5'端周围的结构。EM图中crRNA 5'端的**个观察到的核苷酸是A(-23),被H527,H528和R22包围(图2a,b)。H528靠近A(-23)的5'-氧,而H527远离A(-23),可能靠近A(-24)。

为了测试这些残基的作用,研究人员在每个位置引入了丙氨酸取代。Pre-crRNA切割测定显示,H527或H528的单个突变几乎完全消除,而R22的突变减少了Pre-crRNA切割(图2c)。W511与U(-22)和A(-23)形成PI堆积相互作用,定位pre-crRNA进行切割(图2b)。W511的突变也减少了pre-crRNA的切割(图2c)。因此,WED结构域的H527、H528和R22可能构成RNase催化位点,切割位点可能位于(-23)和(-24)21之间。

结构和生化分析表明,Cas12i通过类似于Cas12a23和Cas13a24的酸碱催化机制处理pre-crRNA,其中H527和H528是酸碱催化剂对,R22是稳定剂。Cas12b中的三个残基和W511不保守,表明Cas12b使用独特的机制进行pre-crRNA加工,例如通过RNase III25。

有趣的是,Cas12i在茎环结构之前的延伸环中切割pre-crRNA,这与Cas12a和Cas6不同,前者切割与5'pseu结相邻的pre-crRNA,后者切割紧邻下游的crRNA茎环结构,但它类似于Cas13a,它也切割重复衍生的茎环27之前的环。


Cas12i的Pre-crRNA加工,底物识别和切割.jpg

图2. Cas12i的Pre-crRNA加工,底物识别和切割

PAM识别

PAM双链体被PI,WED和REC1域识别(图2d)。来自REC1结构域的环和来自WED结构域的环插入PAM双链体的主槽中,并通过氢键识别PAM序列(图2d)。T168与dG(-1)相互作用,而H170和S482与靶链TS的dA(-2)相互作用。

S167与dC(-1*)形成氢键,Y171与NTS的dC(-1*)和dT(-2*)形成堆叠相互作用。

这些残基中任何一个的丙氨酸取代都会导致底物裂解活性降低(图2e)。

将PI结构域中的环插入PAM双链体的小沟中,并靠近NTS中dT(-2*)和dT(-3*)的胸腺嘧啶碱基(图2d);然而,由于该区域的密度不好,没有发现特定的相互作用。除了序列特异性识别之外,许多带正电荷的残基与PAM双链体的磷酸基团形成极性相互作用。

crRNA-DNA异源双链体识别

crRNA-DNA异源双链体被夹在Cas12i带正电荷的中央通道中。两条1-14bp的链与WED,REC1,REC2和RuvC结构域形成广泛的接触,主要是通过碱性残基和双链体的磷酸基团之间的带电相互作用。但是,只有少数Cas12i残基与异源双链体的15-26 bp接触。参与识别crRNA-DNA异源双链体的残基(例如K483,R535和R769)的单个丙氨酸取代仅导致Cas12i切割活性的适度降低。

底物切割

在RuvC活性位点周围观察到与核酸(称为“底物DNA”)一致的密度,这可能来自用于Cas12i-crRNA-DNA复合物组装的过量DNA寡核苷酸。

实际上,TS的序列可以通过模块化形成相应的密度;然而,在目前的分辨率下,明确的分配是不可行的。先前在Cas12b中也观察到催化口袋中存在过量的DNA。Cas12i主要通过催化位点周围的残基、以不依赖序列的方式与亚基DNA结合。

Cas12i对poly-A,-T,-C或-G底物显示出类似的切口酶活性。然而,需要进一步的研究来研究Cas12i的底物偏好。

诱变和底物切割测定表明,RuvC结构域中的三个酸性残基(D647,E894和D1074)构成了催化中心(图2g)。来自Nuc结构域的碱性残基(R962)指向催化中心,对底物切割也至关重要(图2f,g)。该结构表明dG(5)和dA(6)之间有一个切割位点,因为两个核酸之间的易裂磷酸盐很好地朝向催化中心(图2f)。

有趣的是,当来自RuvC结构域的W915或来自Nuc结构域的T944被丙氨酸取代时,NTS的切割被抑制,但TS的切割受损,表明它们在TS切割中起作用(图2g)。

CRISPR Cas12i激活

为了了解激活机制,研究人员分析了野生型Cas12i与crRNA和靶DNA复合的结构。通过三维(3D)分类,确定了Cas12i-crRNA二元复合物的3.9-Å分辨率Cryo-EM结构。

在crRNA发夹被WED和REC1结构域保持并以螺旋构象排列后,立即出现7-nt指导片段(G1-U7),让人联想到在Cas12a和Cas12b中观察到的种子区域。

此外,位于中央带正电通道中的7-nt引导片段暴露于溶剂中,可能有助于与底物的TS杂交。该片段中的单核苷酸错配导致底物切割活性显着降低,表明底物识别可能是从该片段开始的。总之,7-nt片段是Cas12i的合理种子候选者。

通过3D分类,研究人员还观察到了一个中间状态(I1状态),其crRNA-DNA异源双链体为14-15bp,分辨率为3.9Å。二元,I1态和Cas12i–crRNA–dsDNA三元复合物的结构比较表明,14–15 bp crRNA–靶DNA异源双链体的形成导致REC1和REC2向外移动;但是,异源双链体向28bp的传播会诱导REC1向内移动,从而在15-28bp和REC1域之间建立相互作用。crRNA-DNA异源双链体的进展取代了REC2结构域中的一个环(aa 726-737)。删除该环导致切割活性降低,可能是因为激活所需的偶联构象变化被中断。


该研究还捕获到了底物在RuvC结构域活性中心的状态。通过比较Cas12i不同状态的结构发现:在结合底物之前,RuvC结构域中有一个被称为lid motif的区域会遮挡住Cas12i的酶活中心,结合底物之后,lid motif区域发生一个构象变化,暴露出酶活中心。更为有趣的是该特征在其他已知结构的Cas12亚型中也被观察到了,说明了Type V CRISPR-Cas12系统拥有保守的激活机制。


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