蛋白质邻近连接分析技术Proximity ligation assay

什么是蛋白质邻近连接分析？

邻近连接分析，英文Proximity ligation assay，简称PLA, 中文翻译为邻位连接分析或者邻近连接分析技术。

邻近连接分析PLA是一种特殊的免疫分析方法，可用于检测目标蛋白，蛋白相互作用等等。

邻近连接分析PLA由Fredriksson等人于2002年开发。到目前为止，它已成为一种成熟且普遍适用的免疫组化工具，用于高级和精确的蛋白质分析。

邻近连接分析PLA原理图

图1. A: 直接PLA技术 B: 间接PLA技术

蛋白质邻近连接分析技术原理

邻近连接分析PLA技术利用一对寡核苷酸标记的抗体紧密偶联（相距约30-40nm）至复合物中相同蛋白质或两种蛋白质的不同表位。

该技术通过一对标记有一段寡聚脱氧核苷酸(单链DNA)的单克隆或者多克隆抗体的探针，识别目标蛋白，当两个探针识别同一个蛋白时，探针之间的距离靠近，产生了邻近效应。

此时，通过加入一段分别与连接在抗体上的DNA互补的连接寡聚脱氧核苷酸，PLA探针上的DNA就会通过配对互补作用，与该段DNA互补，然后在连接酶的作用下，PLA探针上的DNA片段被连接在一起，形成一条新的DNA片段。

有两种不同的偶联方法：

一种方法使用直接一级抗体偶联（图1 A），另一种使用间接的二级偶联检测（图1 B）。

在直接PLA方法中，两个与短DNA寡核苷酸偶联的一级抗体与目标分子或相互作用分子结合。然后引入两条额外的DNA链，称为连接寡核苷酸。

抗体上的两条DNA链连接到另外引入的两个连接寡核苷酸上，从而形成环状单链DNA分子。

在创建的DNA循环中，一个偶联了DNA探针的抗体用作滚环扩增（rolling circle amplification,RCA）的引物。

因此，当添加DNA聚合酶时，会形成一个长的DNA产物，并保持与一个PLA探针共价连接。在完成滚环扩增RCA后，同一序列的凝聚体重复可实现多种检测寡核苷酸的杂交，可在显微镜下观察、并量化。

PLA的间接形式的原则相同；然而，在这种方法中，未经修饰的一级抗体是用带有DNA链的二级抗体检测的。

邻近连接测定的方法不同于其他基于抗原、抗体反应的原位杂交应用，由于其使用两种抗体、而不是单个抗体，识别相同蛋白的不同表位，从而增加了蛋白特异性。此外，使用两种抗体识别不同蛋白质，既可以显示位置，又可对蛋白质相互作用进行定量。在目标蛋白的内源表达水平上，检测步骤的信号增强为研究稳定和瞬时相互作用提供独有的能力。配合相应的图像处理和分析系统，邻近连接分析非常适合于高通量的细胞为基础的筛选研究。

邻近连接分析用于粘附细胞系、细胞自旋制剂或组织（包括冰冻或石蜡包埋的患者样本）中单个蛋白质或蛋白与蛋白相互作用的局部检测、可视化和定量。细胞或组织需要用适用于邻近连接分析方案中使用的抗体的固定剂固定，如有必要，必须进行抗原回收和抗体特异性阻断。

在未修饰的细胞中，这种创新的方法能够让免疫细胞化学（ICC）和免疫组织化学（IHC）应用所需的蛋白质检测和定量具有很好的特异性和灵敏度。

原位聚乳酸不仅可以检测和计数单个内源性蛋白质，还可以检测和计数蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质修饰。通过利用抗体和DNA特性，增强邻近连接分析的选择性；两个寡核苷酸结合抗体的双重识别提供了蛋白质检测的高选择性，因为单个邻近探针的结合不足以产生检测所需的信号。

此外，DNA和DNA修饰技术的使用允许检测和可视化具有高空间准确性和灵敏度的单个蛋白质分子。

邻近连接分析使用的具体例子

使用常规显微镜，将PLA技术应用于蛋白质组筛选，显著提高了单分子分辨率条件下的原位蛋白质检测的特异性，可以做为临床研究、蛋白质生物标记物验证和常规诊断的强大工具。

PLA蛋白质检测特异性的提高为抗体的高性能和大规模定量验证提供了机会，并用于抗体功能化的原位分析和特定蛋白质表达的大规模分析。

邻近连接分析技术已被用于解决各种生物医学问题，在解决验证临床诊断需要的生物标记物问题方面具有很大的潜力。

PLA已被应用于在肿瘤进展中，研究表皮生长因子受体（EGFR）二聚化、激活，和耐药性形成过程中的作用，以及为EGFR靶向治疗多形性胶质母细胞瘤患者提供更准确地选择。

另一个例子是关于人类表皮生长因子受体（HER）在早期乳腺癌中作用的研究。PLA检测到的HER2-HER2和HER2-HER3复合物水平升高与乳腺癌患者总生存率降低和无复发生存率降低显著相关。

原位聚乳酸进一步用于检测多种蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用和翻译后修饰，以研究靶向治疗对细胞信号传导的同时效应。

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