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RT-PCR实验中的引物二聚体问题及解决方法

作者:PCR实验

PCR技术

PCR实验中的引物二聚体问题解答

问:做RT-PCR电泳后发现有引物二聚体和杂带是什么原因?

应该怎样处理才能解决这个问题?

答:

1、 引物二聚体的产生原因比较多, 其中很重要的一个就是引物自身的原因, 也就是设计的引物特异性不好, 不能有效的和模板进行结合, 而出现引物自身配对结合的情况导致

二聚提的出现; 其次还可能是 PCR 体系及反应条件的问题, 如果 PCR 体系中引物、 镁离子以及酶浓度过高等, 都容易产生二聚体, 这时要适当降低浓度, 比如 20uLPCR 体系中, 一般 10pmol/ul 的引物, 加 0. 2ul 就可以了 ; 还有可能是退火温度的问题, 可以做个梯度PCR 或降落 PCR, 来摸索一个合适的退火温度, 也可有效地减少二聚提的出现。

2、 杂带的出现在很大程度上来源于两个方面: 一是引物的特异性问题, 包括引物的长度和与模板的匹配度等。 二就是退火温度的问题, 一般适当提高退火温度可有效地减少非

特异性扩增, 从而减少杂带的出现。

一般来说减少杂带的方法有: 热启动 PCR(加热启动酶 或 先把 PCR 仪预热) 、 提高退火温度、 做降落 PCR(每个循环降低 0. 5 度) 、 降低底物浓度、 降低镁离子浓度、 减少循环次数等; 其次, 有些共溶剂(甲酰胺, DMSO) 和添加剂(氯化四甲铵, 谷氨酸钾, 硫酸铵)能够降低高水平的错误引导与提高富含 G+C 模板的扩增效率。 另外还需要注意一些细节问题, 如 PCR 反应体系的**在冰上配制, TAq 酶最后加, PCR 结束后产物勿放置在室温下过长时间等。


RT-PCR有杂带和引物二聚体

问:RT中非特异性条带的产生和解决办法

答:

1. 首先, 要排除污染。 建议用 RT 阴性对照检测是否被基因组 DNA 污染。 如果 RT 阴性对照的 PCR 结果也显示同样条带, 则需要用 DNase I 重新处理样品。

2. 在 PCR反应中, 非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。 在低于引物 Tm 2 至 5℃的温度下进行退火, 降低镁离子或是目的 DNA 的量将减少非特异性结果的产生。

3. 由于 mRNA 剪切方式的不同, 根据选择引物的不同将导致产生不同的 RT-PCR 结果。

问:如何解决PCR实验的引物二聚体问题?

答:

1. 从引物自身着手, 重新设计引物, 这是最根本解决这一问题的办法;

2. 可能模板有问题(可能 cDNA 有降解, 这里我考虑你用的 2 步法) ;

3. 模板浓度过小, 适当加大模板量;

4. 降低退火温度后有条带, 则应逐渐提高温度, 若提高温度的同时产物量减少, 则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定, 片段长则相应镁离子浓度应该高一些) ;

5. 若降低退火温度, 发现还是只有引物二聚体, 而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l 没有区别, 则考虑 Buffer 等试剂没有完全融解、 混匀, 导致吸取的试剂浓度不对。

问:PCR时出现较明显引物二聚体, 但无所要目地带, 或部分有较亮目地带仍伴较明显引物二聚体, 我该如何处理?

引物二聚体的形成对目地带的产生及产量有多大影响?

另在PCR时, 我所需目地带应为270bp, 但多次PCR产物跑胶时在约500bp 处可见很亮带, 而270bp 处仅有很淡条带或无目地带, 为什么会这样?该如何处理?

答:

你可以少加点引物或者提高些退火温度, 如果还不行可以考虑换一种引物。

500bp处出现的亮带很可能是污染了, 出现假阳性。关于 pcr 中遇到的假阳性和假阴性等问题你可以参考以下内容:

pcr假阴性和假阳性的原因


出现非特异性扩增带

问:为什么PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致, 或大或小, 或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带?

答:

非特异性条带的出现, 其原因有:

1、是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。

2、是 Mg2+离子浓度过高、 退火温度过低, 及 PCR循环次数过多有关。

3、是酶的质和量, 往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现, 酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有:

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量, 适当增加模板量, 减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性, 65℃左右退火与延伸) 。


问:为什么PCR出现片状拖带或涂抹带?

答:PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。 其原因往往由于酶量过多或酶的质量差, dNTP 浓度过高, Mg2+浓度过高, 退火温度过低, 循环次数过多引起。

其对策有:

①减少酶量, 或调换另一来源的酶。

②减少 dNTP 的浓度。

③适当降低 Mg2+浓度。

④增加模板量, 减少循环次数。


问:为什么会产生引物二聚体?

答:

引物之间两个引物之间不应发生互补, 特别是在引物 3’ 端, 即使无法避免, 其 3'端互补碱基也不应大于 2 个碱基, 否则易生成引物二聚体 Primer dimer。 所谓引物二聚体实

质上是在 DNA 聚合酶作用下, 一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相近的双链 DNA 的片段, 是 PCR 常见的副产品, 有时甚至成为主要产物。

形成引物二聚体原因

1、最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。

2、模板量过低;

3、引物浓度过大;

4、退火时间过长.


问:有哪些方法可以减少引物二聚体的产生?

答:一般减少引物二聚体的方法:

1. 从引物自身着手, 重新设计引物, 这是最根本解决这一问题的办法;

2. 可能模板有问题;

3. 模板浓度过小, 适当加大模板量;

4. Taq 酶, 引物, Mg2+浓度可能过高, 可以适当降低它们的浓度;

5. 取你所要加的上下游引物混合后, 在 100 摄氏度下的沸水中煮 5 分钟, 然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却, 这时再加入反应体系当中, 引物二聚体就会消失的;这点效果还不错;

6. 所配 MIX 中加 5%的甘油或者 5%的 DMSO, 可以增强特异性;

7. PCR 反应体系的配制在冰上进行, 最后加 TAq 酶, PCR 结束后, 产物勿放置在室温下过长时间, 有人认为室温下有些 TAQ 酶会将多余的引物合成为二聚体;

8. 增加循环数;

9. 降低退火温度后有条带, 则应逐渐提高温度, 若提高温度的同时产物量减少, 则考虑增加镁离子浓度,根据扩增片断长度而定, 片段长则相应镁离子浓度应该高一些 ;

10. 若降低退火温度, 发现还是只有引物二聚体, 而且镁离子的浓度在20-25mmol/l 没有区别, 则考虑 Buffer 等试剂没有完全融解、 混匀, 导致吸取的试剂浓度不对;

11. 以上次的 PCR 产物作模板二次 PCR, 可以提高引物与模板的特异性, 减少引物二聚体, 如果两次时间间隔短的话, 可以把原产物稀释 100-1000 倍, 如果间隔较长可以稀释50-100 倍。


还可以可以通过下面的方法来减少引物二聚体:

1. 适度减少引物的浓度(0. 1-0. 5pm) 对于 30 轮放大足够

2. 检查引物的自身结构, 有无复杂的 2 级结构和 FORWARD/REVERSE 之间的配对, 尤其是 3' 端互补结构

3. PCR 反应体系的配制在冰上进行, 最后加 TAq 酶, PCR 结束后, 产物勿放置在室温下过长时间, 有认为室温下有些 TAQ 酶会将多余的引物合成为二聚体。 我试过, 的确如此。

4. 可以考虑加 DMSO, 甘油, BSA 以及其他添加剂, 解除引物二聚体。

5. 如果 PCR产物跑胶足够亮, 可以考虑减少上样量, 以及胶内显色物质(如减少 EB 的量) 一般 PCR体系的引物和dNTP的量是过量的, 产物浓度不够可以适当增加模板量,而不是引物和dNTP。

PCR 时, 引物不要加太多, 退火温度适当调高一点。


不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开。 而与延伸的时间和温度是没有关系的, 解开后它们就和其他单链一样有着平等的与模板结合的机会。而且这些半

拉子产物比引物更容易与模板结合, 首先完成了 合成全长单链(酶的催化速率不变, 此时所需要的时间当然短) . 也就是说到 30 个循环后, 绝大部分都已经完成了全长链的合成, 只有

少部分形成了长短不一的单链,这已经不是引物二聚体了 。


普通的 PCR 体系来说, 30 和 34个循环的引物和 dNTP 的量没什么差别, 一般来说这两个都是过量的, 循环数多了容易发生错配以及酶效率下降的现象, 不过一般来说 40 以内没有什么大问题。


片段长度对PCR扩增的影响

如果是 600bp那就用普通酶扩增即可, 因为普通Taq酶在500bp 左右得到的片段是完全可信的, 较大的片段可以用带有校正功能的酶来PCR。

如果你实验室经济条件较好的话, 建议你选用高保真酶, 或 HotStart 酶; 还有个可选的方法, 就是直接把目的片段切胶回收, 以回收得到的片段再做为模板进行 PCR, 这些就能得到大量的目的片段, 相信对于较小片段来说, 这一点点的突变率可以忽略不计了。

引物二聚体的形成不在于酶, 在于你引物的设计。 我不知道你是手动设计的引物呢, 还是用软件设计的引物。 引物设计的不合理, 造成上下游引物之间形成互配的可能, 或者引物自身两端碱基也可以互补的话, 就很容易形成二聚体。

世界上没有十全十美的事物, 要想设计出的引物完全不会出现二聚体也是不太可能实现的, 所以只要目的条带能 P出来而且产量明显高于二聚体, 这也算引物设计比较成功了 。


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Magicscript 耐热逆转录酶 III 100A003S100µl1580
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