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逆转录过程和逆转录病毒的逆转录

作者:美格生物

RT-PCR/分子诊断常用酶

逆转录过程和逆转录病毒的逆转录

什么是逆转录?

逆转录,英文是reverse-transcription,是逆转录酶用RNA模板生成互补DNA (cDNA)的过程。

逆转录的概念最初不被接受,因为它与分子生物学的中心教义相矛盾,即DNA被转录成RNA,然后被翻译成蛋白质。然而,1970年,当科学家Howard Temin和David Baltimore发现了负责逆转录的酶,即逆转录酶时,遗传信息以这种方式传递的可能性终于被接受了。

➢逆转录酶种类

目前通过深入研究的逆转录酶包含:

▸ 莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶MMLV,它是单个75kDa单体;

▸ 禽骨髓母细胞增多症病毒的AMV逆转录酶,它有两个亚基,一个63kDa亚基和一个95kDa亚基;

▸ 人类免疫缺陷病毒1型的HIV-1逆转录酶,PDB:1HMV,它具有两个分子量分别为66和51kDa的亚基;

▸ 维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶


逆转录酶在病毒中的作用

逆转录酶由逆转录病毒编码和使用,逆转录病毒在复制过程中使用这种酶。逆转录病毒等逆转录RNA病毒利用RT酶将其RNA基因组逆转录成DNA,然后将其整合到宿主基因组中,并与之一起复制。反转录DNA病毒,如嗜肝病毒,可以使RNA作为组装和制造DNA链的模板。艾滋病病毒通过使用RT酶感染人类。如果没有逆转录酶,病毒基因组将无法整合到宿主细胞中,导致复制失败。

逆转录过程

逆转录酶从RNA模板中产生单链DNA。


逆转录酶与转录过程.png

图1. 逆转录酶反应示意图                       (美格生物提供)


在逆转录酶缺乏DNA聚合酶活性的病毒物种中,双链DNA的产生可能通过宿主编码的DNA聚合酶δ来完成,它将病毒DNA-RNA误认为引物,并通过使用与引物去除类似的机制,即用新合成的DNA取代原始RNA模板,合成双链DNA。


逆转录过程极易出错,正是在这一步骤中可能发生突变。这种突变可能会引起耐药性。

逆转录病毒的逆转录过程

逆转录病毒,也称为VI类ssRNA-RT病毒,是具有DNA中间体的RNA逆转录病毒。它们的基因组由两个带5’帽和3’聚腺苷酸尾部的正单链RNA分子组成。逆转录病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)和人类嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)。在胞质溶胶中,双链DNA的产生以一系列步骤进行:


1、一种特定的细胞tRNA充当引物,并与病毒RNA基因组的互补部分杂交,该互补部分称为引物结合位点或PBS。

2、然后,互补DNA与病毒RNA的U5(非编码区)和R区(在RNA分子两端发现的直接重复序列)结合。

3、逆转录酶上一个称为RNAse H的结构域降解RNA的5'端,从而去除U5和R区。

4、然后,引物“跳”到病毒基因组的3'端,新合成的DNA链与RNA上的互补R区杂交。

5、**链互补DNA(cDNA)被延伸,大部分病毒RNA被RNAse H降解。

6、一旦链完成,就从病毒RNA开始第二链合成。

7、然后是另一个“跳跃”,来自第二链的PBS与**链上的互补PBS杂交。

8、这两条链都进一步延伸,并可以通过整合酶整合到宿主基因组中。


逆转录病毒的逆转录过程

图2. 逆转录病毒的逆转录过程                                 (美格生物提供)


双链DNA的产生还涉及链转移,在链转移中,短DNA产物从最初的RNA依赖性DNA合成转移到基因组另一端的受体模板区域,随后,逆转录酶到达这些区域,利用其DNA依赖性DNA活性进行处理。


逆转录病毒核糖核酸排列在5'末端至3'末端。引物与病毒RNA退火的位点被称为引物结合位点(PBS)。连接到PBS位点的RNA5’端被称为U5,连接到PBS的RNA3’端被称作前导。tRNA引物在14至22个核苷酸之间展开,并在PBS中与病毒RNA形成碱基配对的双链体。PBS位于病毒RNA的5'末端附近这一事实是不寻常的,因为逆转录酶从引物的3'末端沿5'到3'方向(相对于RNA模板)合成DNA。因此,引物和逆转录酶必须重新定位到病毒RNA的3'端。为了完成这种重新定位,需要多个步骤和各种酶,包括DNA聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H)和多核苷酸解链。


HIV逆转录酶还具有在cDNA合成过程中降解病毒RNA的核糖核酸酶活性,以及将有义cDNA链复制到反义DNA中以形成双链病毒DNA中间体(vDNA)的DNA依赖性DNA聚合酶活性。

➢真核生物的逆转录过程

利用逆转录酶,称为逆转录转座子的真核生物基因组的自我复制片段通过RNA中间体从基因组中的一个位置移动到另一个位置。它们大量存在于动植物的基因组中。端粒酶是在包括人类在内的许多真核生物中发现的另一种逆转录酶,它携带自己的RNA模板;该RNA用作DNA复制的模板。

➢原核生物的逆转录过程

原核生物中逆转录酶的初步报道早在1971年就有了。此后,这些被广泛描述为细菌逆转录酶的一部分,细菌逆转录酶是编码逆转录酶的不同序列,并用于合成msDNA。为了启动DNA的合成,需要引物。在细菌中,引物是在复制过程中合成的。


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