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蛋白纯化实战: 蛋白提取纯化具体步骤

作者:蛋白纯化技术

蛋白纯化的步骤


蛋白质的分离纯化是一项重要的生物操作技术,蛋白纯化被广泛使用在生物化学研究、药物研制等领域。


高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。

如何进行蛋白纯化?


蛋白提取纯化的步骤程序

蛋白分离纯化的一般步骤可以分为前处理、粗分离、精细分离三个部分。


蛋白纯化步骤1.jpg

图1. 蛋白分离纯化的一般步骤


1、预处理

预处理分离纯化某种蛋白质,首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,并保持蛋白原来的天然状态,不丢失生物活性。


为此,动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受单宁等物质的污染,油料种子**先用低沸点的有机溶剂如乙醚等进行脱脂。然后根据不同的情况,选择适当的方法,将组织和细胞进行破碎。


破碎细胞

动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机进行破碎,或着用超声波处理进行细胞破碎。植物组织和细胞一般需要用石英砂或着玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法,或用纤维素酶处理也可以达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦,破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等方法。


溶解蛋白

组织和细胞破碎后,选择适当的缓冲液把所要的蛋白提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤的方法除去。


如果所要的蛋白主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质等,则可利用差速离心的方法将它们分开,收集该细胞组分作为下步纯化的材料。如果碰上所要蛋白是与细胞膜或膜质细胞器结合的,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当介质提取。


2、粗提蛋白

当获得蛋白质提取液后,有时里面还夹杂有核酸、多糖之类的东西,要选用适当的方法,将所要的蛋白与其他杂蛋白分离开来。

这一步一般采用超滤、盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大,既可以除去大量杂质,又可以浓缩蛋白溶液。


3、精提蛋白

蛋白样品经粗提分级分离后,一般体积较小,杂蛋白大部分已被除去。要进一步纯化,一般使用层析法,包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析以及分子筛等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小,但分辨率很高。


4. 结晶保存

结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶过程并不能保证蛋白一定是均一的,但是只有某种蛋白在溶液中数量上占有优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化,而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白。由于结晶过程中从未发现过变性蛋白,因此蛋白的结晶不仅是纯度的一个标志,也是断定制品处于天然状态的有力指标。


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