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基因编辑CRISPR/Cas系统中Cas9/Cas12/Cas13结构特点作者:柳叶刀 基因编辑技术CRISPR/Cas系统基于CRISPR/Cas的方法为利用基因治疗和免疫疗法治疗癌症提供了一条巧妙的途径。癌症治疗方法中使用的CRISPR/Cas系统主要基于Cas核酸酶(Cas9、Cas12a和Cas13a)及其同源物。 CRISPR/Cas9系统通常被用作大多数物种的基因工程工具。 Cas9是一种crRNA引导的核酸内切酶,包含两个称为RuvC和HNH的结构域,参与切割双链DNA(dsDNA)。此外,要形成RNP复合物(Cas9–crRNA–tracrRNA核糖核蛋白)需要CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。最常见的Cas9是化脓性链球菌Cas9(SpCas9),它能够通过原间隔区相邻基序(PAM)识别靶向DNA(图1)。在Cas9介导的DNA切割后,通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)途径使基因编辑产生作用。金黄色葡萄球菌Cas9(SaCas9)是Cas9的一种变体,具有独特的PAM识别能力,可以靶向5′-NNRRT PAM。最近,研究人员发现了CRISPR/CasX,一种Cas9的变体,它更小,在基因编辑方面更有效,被认为是所有变体中最小的。此外,通过将CRISPR/Cas9修饰成核酸酶缺陷系统(称为dCas9),并融合额外的效应结构域,该系统可以重新用于各种目的。具体而言,与KRAB结构域(一种转录抑制结构域)融合的CRISPR/dCas9-KRAB系统用于干扰靶基因转录。以这种方式创建的CRISPR干扰(CRISPRi)系统可以用于多种目的,例如癌症诊断和治疗。 图1. CRISPR/Cas9基因编辑 Seyed Esmaeil Ahmadi CRISPR/Cas系统的一个显著优点是,它可以很容易地进行修改以执行各种功能。Cas9可以诱导DSB, 并高精度编辑基因,或者借助修饰的Cas9酶如dCas9进行编辑;该系统可用作转录激活因子(CRISPRa)或转录抑制因子(CRISPRi)。 CRISPR系统具有独特功能的另一种核酸内切酶是Cas12a(所谓的Cpf1)。 与在DNA中产生钝端的Cas9相反,Cas12a能够以独特的切割模式交错末端,促进DNA在严格位置的整合。值得注意的是,Cas12a酶不需要tracrRNA,而是自己处理pre-crRNA。为了覆盖广泛的靶向基因座,研究人员开发了Cas12a变体以靶向不同的PAM(5'-TATV,5'-VTTV,5'-TTTT,5'-TATV,5'-TTCN)。此外,Magigen CRISPR/Cas12a系统可以检测样品中的病毒DNA,尽管它取决于单链DNA(ssDNA)的非特异性切割。这种特殊的CRISPR系统似乎有可能为多重基因组编辑的工具,它在癌症治疗中的应用可能会更广泛。 Cas13a也称为C2c2,是一种新型的RNA引导核酸内切酶,具有靶向RNA的能力。 在识别和附着RNA后,CRISPR Cas13a可以并行切割非靶向RNA。到目前为止,尚未发现Cas13a在真核生物中的功能,其作用机制尚不完全清楚。能够靶向RNA的CRISPR系统已被用于临床研究,用于检测RNA病毒和肿瘤衍生的循环RNA(circulating RNA)。通过基因编辑方法(尤其是CRISPR)改变不同类型的RNA,如信使RNA(mRNA),microRNA(miR),长非编码RNA(lncRNA)和环状RNA(circRNA),在癌症治疗中具有巨大潜力。 根据有多少Cas核酸内切酶参与其机制,CRISPR/Cas系统分为两类。 I类使用多种Cas蛋白进行操作,而II类需要单一种Cas酶。与I类CRISPR/Cas系统相比,II类Cas系统中涉及的元件(Cas蛋白,crRNA和tracrRNA)可以更容易地生成;因此,它将是一种更具吸引力的基因编辑选择。CRISPR/Cas9是一种crRNA引导的核酸内切酶,包含两个结构域HNH和RuvC,分别切割互补和非互补DNA链。为了促进动物基因操作,CRISPR/Cas9的crRNA和tracrRNA元件已被单指导RNA(sgRNA)取代。SgRNA在5'末端的20个核苷酸与靶基因结合,而其3'双链体能够与Cas9相互作用,确保准确和引导的基因编辑。Cas9应该在Cas9诱导的双链断裂(DSB)之前识别目标DNA旁边的PAM。之后,Cas9经历构象变化,使其能够在PAM上游执行三到四个核苷酸的DSB。之后,Cas9发生构象转变,使其在PAM上游执行三到四个核苷酸的DSB。在Cas9诱导的DSB后,DNA修复途径(例如NHEJ和HDR)被激活。 由于NEHJ作为主要的DSB修复途径,无论同源模板如何,都会连接DNA断裂末端,因此,由于任意核苷酸插入和缺失(indels),连接过程中存在错误的风险,这可能导致基因中的移码和无义突变。除了基因改变外,NHEJ在用两种不同的sgRNA进行DNA修复时还可能导致缺失。NHEJ的这些作用可能有益于治疗特定蛋白质过量产生的疾病。 HDR途径以更高的精度修复DNA,因为基因插入需要一段与染色体DNA靶向部分同源的DNA模板。这使得转基因在基于DSBs HDR的基因组编辑后能够以更高的特异性整合,这可能有利于基因缺失引起的疾病,如X连锁视网膜色素变性、血友病A/B和苯丙酮尿症。 然而,NHEJ在哺乳动物细胞中优于HDR,原因有几个:NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的,而HDR仅在S/G2期活跃,NHEJ比HDR快。NHEJ的使用超过了HDR,特别是在终末分化的细胞中,例如神经元,心肌细胞和成熟的肌肉细胞。 尽管有替代方法,例如同源性非依赖性靶向整合(HITI),同源性介导的末端连接(HMEJ)和微同源性介导的末端连接(MMEJ),但由于这些修复途径提供了编辑基因的简单方法,因此它们已成为癌症研究中最常用的策略。 癌症诊断和治疗的临床转译 CRISPR/Cas技术提供了一个典型的基因编辑应用,尽管在临床癌症治疗的情况下,它并不是主要的参与者。也就是说,基于CRISPR的基因组编辑的潜力在不久的将来有望用于癌症诊断和治疗。 CRISPR-Cas9靶向的DNA片段化可以用作确定癌症特异性序列变化的手段。例如,CRISPR/Cas9可以检测微卫星序列,称为短串联重复序列(STRs),可以作为癌症标志物。大多数STR分析依赖于PCR扩增子,而PCR扩增子**于少数。相比之下,CRISPR/Cas9介导的STR测序能够准确灵敏地并行分析2000多个STR。人类基因组中有一些区域包含复杂的兆大小的碱基片段,其中包含生物学上必需的基因。由于它们的复杂性和变异性,这些区域并没有被彻底发现,尽管Baker及其同事使用了一种称为CISMR(CRISPR介导的基因组特定兆大小碱基区域的分离)的潜在方法,用于这些片段的靶向测序。此外,如果将CRISPR介导的基因组DNA片段化与双链测序相结合,纠正测序错误,则可以在低DNA输入的情况下进行超准确测序,称为CRISPR-DS。与双链测序相比,CRISPR-DS在检测卵巢癌患者腹膜液中TP53突变方面具有优越的能力,其DNA比后者少10至100倍。鉴于CRISPR-DS的诊断潜力,它现已进入临床试验阶段[NCT03606486]。其他高度准确的酶核酸检测系统也被开发用于癌症相关突变,称为DETECTR和SHERLOCK,分别使用CRISPR Cas12a和Cas13。 除了癌症诊断之外,CRISPR还被应用于临床癌症治疗,这证明了最近开发的基因编辑工具的惊人潜力。最初,CRISPR/Cas9系统于2016年在四川大学华西医院用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)。在那项研究中,患者的T细胞经过基因工程改造,不表达T细胞活化抑制剂PD-1。因此,这种方法也被用于其他组织的癌症,包括膀胱癌,前列腺癌,肾癌和食管癌。值得注意的是,其中一些临床试验已经撤回了他们的研究。 CAR T细胞受体的发展在癌症治疗方面取得了重大进展,Kymriah和Yescarta(CAR T细胞抗CD19)被FDA批准用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤。尽管自体CAR T细胞治疗取得了令人鼓舞的结果,但仍有一些局限性需要解决。例如,在某些情况下,例如婴儿,可能没有足够的T细胞来产生CAR-T细胞并进行自体移植。CRISPR/Cas系统可以整合到CAR T细胞工程中,从健康供体产生通用CAR T细胞。 病毒载体以随机方式将CAR基因整合到T细胞中,而不是以位点特异性方式,这可能会对基因组产生不利影响。Eyquem等人使用基于CRISPR/Cas9的CD19特异性CAR基因与T细胞受体α恒定(TRAC)基因座的位点特异性整合。这些工程化的CAR T细胞在靶向急性淋巴细胞白血病细胞的安全性、精确度和有效性方面优于前几代。 CAR-T细胞诱导的细胞因子风暴和神经炎症不是有利的结果,被认为是GM-CSF的作用。因此,为了解决这些局限性,lenzilumab已被用于抑制GM-CSF,这不仅减少了CAR-T细胞疗法的副作用,而且增加了其增殖,并改善了白血病的控制。据此,Sterner及其同事用CRISPR/Cas9系统制造了GM-CSF敲除的CAR-T细胞,该系统显示出显着的体内抗肿瘤活性,同时将副作用保持在最低水平。 通过CAR T细胞靶向CD33(急性髓性白血病AML中的髓样标志物)导致由于正常髓样细胞的破坏而引起的诱导毒性。一种复杂的方法,CRISPR/Cas9介导的从正常干细胞中敲除CD33基因,然后在恒河猴中进行自体移植,为CD33特异性CAR T细胞介导的白血病细胞消除铺平了道路,而不影响正常的造血干细胞。此外,多重CRISPR-Cas9系统已被用于同时敲除T细胞中的多个基因,包括T细胞受体(TCR)链和PD-1。这可以产生癌症特异性T细胞(NY-ESO-1),其具有诸如与靶标的轻微错配配对,增强的耐久性以及提供无风险移植物抗宿主病(GVHD)等特征。所有这些努力都清楚地表明,CRISPR/Cas9系统是改善癌症免疫治疗的重要武器。 一些病毒能够引发人类癌症,如乙型肝炎和丙型肝炎病毒(HBV和HCV),人乳头瘤病毒(HPV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV),它们可以引起肝细胞癌(HCC),宫颈癌和伯基特淋巴瘤。鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人类细胞,它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有效工具。 HBV在HCC中的作用与肝细胞中HBV的共价闭环DNA(cccDNA)的活性密切相关。许多研究表明,CRISPR/Cas9诱导的HBV cccDNA突变可以降低其水平,损害病毒复制。此外,在CRISP/Cas系统的帮助下,证明了lncRNA PCNAP1通过调节miR-154/PCNA/HBV cccDNA信号传导促进HBV复制并促进肝癌发生。此外,HCV也有助于HCC的发展。在最近的一项研究中,新弗朗西斯菌(FnCas9)是一种可以靶向DNA和RNA病毒的Cas9,用于抑制HCC细胞内HCV的ssRNA。FnCas9的潜力似乎有望用于靶向不同类型的致癌病毒。 HPV感染的持续存在可导致宫颈癌的发展,每年导致近200000名患者死亡。在HPV功能蛋白中,E6和E7与HPV的致癌特性有关。这两种蛋白质能够破坏细胞中的主要肿瘤抑制因子,包括p53和Rb。基于此,研究人员使用CRISPR/Cas9系统抑制HPV-16和HPV-18的E6和E7基因,然后恢复p53和Rb的表达,导致癌细胞凋亡。 EBV是另一种主要与伯基特淋巴瘤相关的致癌病毒,已被CRISPR/Cas9靶向。Wang等人指出,在来自潜伏EBV感染患者的伯基特淋巴瘤细胞中,通过CRISPR/Cas9靶向EBV基因,如EBNA-1,LMP-1或EBNA-3C,导致细胞增殖急剧减少,病毒载量减少。这种方法也得到了其他研究的支持,并且由于EBV引起几种类型的恶性肿瘤,因此基于CRISPR/Cas9的靶向治疗可以有效预防这些疾病。 结论 尽管CRISPR系统是最近才开发出来的,但它在癌症诊断和治疗方面已经取得了重大进展。研究人员可以使用CRISPR/Cas在体外,体内或离体抑制或诱导基因表达。尽管CRISPR面临一些挑战,但由于其在精确癌症治疗和免疫治疗方面的潜力,近年来引起了人们的广泛关注。 尽管CRISPR在癌症诊断和治疗中具有广泛的实用性,但仍存在未来应解决的局限性和担忧。其中之一是CRISPR/Cas诱导的DSB的可能性,导致基因组中不必要的大缺失,并且在最坏的情况下,它可能导致染色体萎缩,这可能破坏肿瘤抑制因子和细胞调节系统。另一个问题是CRISPR/Cas系统的脱靶效应,尽管在本综述中提到了一些解决方案来避免它们。人们一直担心脱靶效应,这可能导致CRISPR诱导的癌症生长,但好消息是还没有证据表明情况如此。值得注意的是,通过使用精确的协议和标准,可以将这些影响降至最低。由于广泛使用的Cas9来自细菌,因此预先存在的对它的免疫力可以被认为是CRISPR/Cas系统的限制。在这种情况下,修饰Cas酶并产生具有不同抗原特性的变体可能会有所帮助。 扩展阅读
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