基因编辑技术

CRISPR/Cas系统

基于CRISPR/Cas的方法为利用基因治疗和免疫疗法治疗癌症提供了一条巧妙的途径。癌症治疗方法中使用的CRISPR/Cas系统主要基于Cas核酸酶（Cas9、Cas12a和Cas13a）及其同源物。

CRISPR/Cas9系统通常被用作大多数物种的基因工程工具。

Cas9是一种crRNA引导的核酸内切酶，包含两个称为RuvC和HNH的结构域，参与切割双链DNA（dsDNA）。此外，要形成RNP复合物（Cas9–crRNA–tracrRNA核糖核蛋白）需要CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）。最常见的Cas9是化脓性链球菌Cas9（SpCas9），它能够通过原间隔区相邻基序（PAM）识别靶向DNA（图1）。在Cas9介导的DNA切割后，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）途径使基因编辑产生作用。金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）是Cas9的一种变体，具有独特的PAM识别能力，可以靶向5′-NNRRT PAM。最近，研究人员发现了CRISPR/CasX，一种Cas9的变体，它更小，在基因编辑方面更有效，被认为是所有变体中最小的。此外，通过将CRISPR/Cas9修饰成核酸酶缺陷系统（称为dCas9）,并融合额外的效应结构域，该系统可以重新用于各种目的。具体而言，与KRAB结构域（一种转录抑制结构域）融合的CRISPR/dCas9-KRAB系统用于干扰靶基因转录。以这种方式创建的CRISPR干扰（CRISPRi）系统可以用于多种目的，例如癌症诊断和治疗。

图1. CRISPR/Cas9基因编辑                                                   Seyed Esmaeil Ahmadi

CRISPR/Cas系统的一个显著优点是，它可以很容易地进行修改以执行各种功能。Cas9可以诱导DSB, 并高精度编辑基因，或者借助修饰的Cas9酶如dCas9进行编辑；该系统可用作转录激活因子（CRISPRa）或转录抑制因子（CRISPRi）。

CRISPR系统具有独特功能的另一种核酸内切酶是Cas12a（所谓的Cpf1）。

与在DNA中产生钝端的Cas9相反，Cas12a能够以独特的切割模式交错末端，促进DNA在严格位置的整合。值得注意的是，Cas12a酶不需要tracrRNA，而是自己处理pre-crRNA。为了覆盖广泛的靶向基因座，研究人员开发了Cas12a变体以靶向不同的PAM（5'-TATV，5'-VTTV，5'-TTTT，5'-TATV，5'-TTCN）。此外，Magigen CRISPR/Cas12a系统可以检测样品中的病毒DNA，尽管它取决于单链DNA（ssDNA）的非特异性切割。这种特殊的CRISPR系统似乎有可能为多重基因组编辑的工具，它在癌症治疗中的应用可能会更广泛。

Cas13a也称为C2c2，是一种新型的RNA引导核酸内切酶，具有靶向RNA的能力。

在识别和附着RNA后，CRISPR Cas13a可以并行切割非靶向RNA。到目前为止，尚未发现Cas13a在真核生物中的功能，其作用机制尚不完全清楚。能够靶向RNA的CRISPR系统已被用于临床研究，用于检测RNA病毒和肿瘤衍生的循环RNA（circulating RNA）。通过基因编辑方法（尤其是CRISPR）改变不同类型的RNA，如信使RNA（mRNA），microRNA（miR），长非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA），在癌症治疗中具有巨大潜力。

根据有多少Cas核酸内切酶参与其机制，CRISPR/Cas系统分为两类。

I类使用多种Cas蛋白进行操作，而II类需要单一种Cas酶。与I类CRISPR/Cas系统相比，II类Cas系统中涉及的元件（Cas蛋白，crRNA和tracrRNA）可以更容易地生成；因此，它将是一种更具吸引力的基因编辑选择。CRISPR/Cas9是一种crRNA引导的核酸内切酶，包含两个结构域HNH和RuvC，分别切割互补和非互补DNA链。为了促进动物基因操作，CRISPR/Cas9的crRNA和tracrRNA元件已被单指导RNA（sgRNA）取代。SgRNA在5'末端的20个核苷酸与靶基因结合，而其3'双链体能够与Cas9相互作用，确保准确和引导的基因编辑。Cas9应该在Cas9诱导的双链断裂（DSB）之前识别目标DNA旁边的PAM。之后，Cas9经历构象变化，使其能够在PAM上游执行三到四个核苷酸的DSB。之后，Cas9发生构象转变，使其在PAM上游执行三到四个核苷酸的DSB。在Cas9诱导的DSB后，DNA修复途径（例如NHEJ和HDR）被激活。

由于NEHJ作为主要的DSB修复途径，无论同源模板如何，都会连接DNA断裂末端，因此，由于任意核苷酸插入和缺失（indels），连接过程中存在错误的风险，这可能导致基因中的移码和无义突变。除了基因改变外，NHEJ在用两种不同的sgRNA进行DNA修复时还可能导致缺失。NHEJ的这些作用可能有益于治疗特定蛋白质过量产生的疾病。

HDR途径以更高的精度修复DNA，因为基因插入需要一段与染色体DNA靶向部分同源的DNA模板。这使得转基因在基于DSBs HDR的基因组编辑后能够以更高的特异性整合，这可能有利于基因缺失引起的疾病，如X连锁视网膜色素变性、血友病A/B和苯丙酮尿症。

然而，NHEJ在哺乳动物细胞中优于HDR，原因有几个：NHEJ在整个细胞周期中都是活跃的，而HDR仅在S/G2期活跃，NHEJ比HDR快。NHEJ的使用超过了HDR，特别是在终末分化的细胞中，例如神经元，心肌细胞和成熟的肌肉细胞。

尽管有替代方法，例如同源性非依赖性靶向整合（HITI），同源性介导的末端连接（HMEJ）和微同源性介导的末端连接（MMEJ），但由于这些修复途径提供了编辑基因的简单方法，因此它们已成为癌症研究中最常用的策略。

癌症诊断和治疗的临床转译

CRISPR/Cas技术提供了一个典型的基因编辑应用，尽管在临床癌症治疗的情况下，它并不是主要的参与者。也就是说，基于CRISPR的基因组编辑的潜力在不久的将来有望用于癌症诊断和治疗。

CRISPR-Cas9靶向的DNA片段化可以用作确定癌症特异性序列变化的手段。例如，CRISPR/Cas9可以检测微卫星序列，称为短串联重复序列（STRs），可以作为癌症标志物。大多数STR分析依赖于PCR扩增子，而PCR扩增子**于少数。相比之下，CRISPR/Cas9介导的STR测序能够准确灵敏地并行分析2000多个STR。人类基因组中有一些区域包含复杂的兆大小的碱基片段，其中包含生物学上必需的基因。由于它们的复杂性和变异性，这些区域并没有被彻底发现，尽管Baker及其同事使用了一种称为CISMR（CRISPR介导的基因组特定兆大小碱基区域的分离）的潜在方法，用于这些片段的靶向测序。此外，如果将CRISPR介导的基因组DNA片段化与双链测序相结合，纠正测序错误，则可以在低DNA输入的情况下进行超准确测序，称为CRISPR-DS。与双链测序相比，CRISPR-DS在检测卵巢癌患者腹膜液中TP53突变方面具有优越的能力，其DNA比后者少10至100倍。鉴于CRISPR-DS的诊断潜力，它现已进入临床试验阶段[NCT03606486]。其他高度准确的酶核酸检测系统也被开发用于癌症相关突变，称为DETECTR和SHERLOCK，分别使用CRISPR Cas12a和Cas13。

除了癌症诊断之外，CRISPR还被应用于临床癌症治疗，这证明了最近开发的基因编辑工具的惊人潜力。最初，CRISPR/Cas9系统于2016年在四川大学华西医院用于治疗非小细胞肺癌（NSCLC）。在那项研究中，患者的T细胞经过基因工程改造，不表达T细胞活化抑制剂PD-1。因此，这种方法也被用于其他组织的癌症，包括膀胱癌，前列腺癌，肾癌和食管癌。值得注意的是，其中一些临床试验已经撤回了他们的研究。

CAR T细胞受体的发展在癌症治疗方面取得了重大进展，Kymriah和Yescarta（CAR T细胞抗CD19）被FDA批准用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤。尽管自体CAR T细胞治疗取得了令人鼓舞的结果，但仍有一些局限性需要解决。例如，在某些情况下，例如婴儿，可能没有足够的T细胞来产生CAR-T细胞并进行自体移植。CRISPR/Cas系统可以整合到CAR T细胞工程中，从健康供体产生通用CAR T细胞。

病毒载体以随机方式将CAR基因整合到T细胞中，而不是以位点特异性方式，这可能会对基因组产生不利影响。Eyquem等人使用基于CRISPR/Cas9的CD19特异性CAR基因与T细胞受体α恒定（TRAC）基因座的位点特异性整合。这些工程化的CAR T细胞在靶向急性淋巴细胞白血病细胞的安全性、精确度和有效性方面优于前几代。

CAR-T细胞诱导的细胞因子风暴和神经炎症不是有利的结果，被认为是GM-CSF的作用。因此，为了解决这些局限性，lenzilumab已被用于抑制GM-CSF，这不仅减少了CAR-T细胞疗法的副作用，而且增加了其增殖，并改善了白血病的控制。据此，Sterner及其同事用CRISPR/Cas9系统制造了GM-CSF敲除的CAR-T细胞，该系统显示出显着的体内抗肿瘤活性，同时将副作用保持在最低水平。

通过CAR T细胞靶向CD33（急性髓性白血病AML中的髓样标志物）导致由于正常髓样细胞的破坏而引起的诱导毒性。一种复杂的方法，CRISPR/Cas9介导的从正常干细胞中敲除CD33基因，然后在恒河猴中进行自体移植，为CD33特异性CAR T细胞介导的白血病细胞消除铺平了道路，而不影响正常的造血干细胞。此外，多重CRISPR-Cas9系统已被用于同时敲除T细胞中的多个基因，包括T细胞受体（TCR）链和PD-1。这可以产生癌症特异性T细胞（NY-ESO-1），其具有诸如与靶标的轻微错配配对，增强的耐久性以及提供无风险移植物抗宿主病（GVHD）等特征。所有这些努力都清楚地表明，CRISPR/Cas9系统是改善癌症免疫治疗的重要武器。

一些病毒能够引发人类癌症，如乙型肝炎和丙型肝炎病毒（HBV和HCV），人乳头瘤病毒（HPV）和爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV），它们可以引起肝细胞癌（HCC），宫颈癌和伯基特淋巴瘤。鉴于CRISPR/Cas系统可以引入人类细胞，它可能是保护我们免受致癌病毒侵害的有效工具。

HBV在HCC中的作用与肝细胞中HBV的共价闭环DNA（cccDNA）的活性密切相关。许多研究表明，CRISPR/Cas9诱导的HBV cccDNA突变可以降低其水平，损害病毒复制。此外，在CRISP/Cas系统的帮助下，证明了lncRNA PCNAP1通过调节miR-154/PCNA/HBV cccDNA信号传导促进HBV复制并促进肝癌发生。此外，HCV也有助于HCC的发展。在最近的一项研究中，新弗朗西斯菌（FnCas9）是一种可以靶向DNA和RNA病毒的Cas9，用于抑制HCC细胞内HCV的ssRNA。FnCas9的潜力似乎有望用于靶向不同类型的致癌病毒。

HPV感染的持续存在可导致宫颈癌的发展，每年导致近200000名患者死亡。在HPV功能蛋白中，E6和E7与HPV的致癌特性有关。这两种蛋白质能够破坏细胞中的主要肿瘤抑制因子，包括p53和Rb。基于此，研究人员使用CRISPR/Cas9系统抑制HPV-16和HPV-18的E6和E7基因，然后恢复p53和Rb的表达，导致癌细胞凋亡。

EBV是另一种主要与伯基特淋巴瘤相关的致癌病毒，已被CRISPR/Cas9靶向。Wang等人指出，在来自潜伏EBV感染患者的伯基特淋巴瘤细胞中，通过CRISPR/Cas9靶向EBV基因，如EBNA-1，LMP-1或EBNA-3C，导致细胞增殖急剧减少，病毒载量减少。这种方法也得到了其他研究的支持，并且由于EBV引起几种类型的恶性肿瘤，因此基于CRISPR/Cas9的靶向治疗可以有效预防这些疾病。

结论

尽管CRISPR系统是最近才开发出来的，但它在癌症诊断和治疗方面已经取得了重大进展。研究人员可以使用CRISPR/Cas在体外，体内或离体抑制或诱导基因表达。尽管CRISPR面临一些挑战，但由于其在精确癌症治疗和免疫治疗方面的潜力，近年来引起了人们的广泛关注。

尽管CRISPR在癌症诊断和治疗中具有广泛的实用性，但仍存在未来应解决的局限性和担忧。其中之一是CRISPR/Cas诱导的DSB的可能性，导致基因组中不必要的大缺失，并且在最坏的情况下，它可能导致染色体萎缩，这可能破坏肿瘤抑制因子和细胞调节系统。另一个问题是CRISPR/Cas系统的脱靶效应，尽管在本综述中提到了一些解决方案来避免它们。人们一直担心脱靶效应，这可能导致CRISPR诱导的癌症生长，但好消息是还没有证据表明情况如此。值得注意的是，通过使用精确的协议和标准，可以将这些影响降至最低。由于广泛使用的Cas9来自细菌，因此预先存在的对它的免疫力可以被认为是CRISPR/Cas系统的限制。在这种情况下，修饰Cas酶并产生具有不同抗原特性的变体可能会有所帮助。

扩展阅读

CRISPR/Cas12i系统的结构和工作机理详解