哈佛专家论述CRISPR检测技术的开发与应用以及发展方向

前言

快速准确地诊断疾病是有效治疗和进行长期预防的关键。基于核酸的与疾病相关的生物标志物对于来说诊断是必不可少的，因为DNA或RNA可以从微量样本中扩增出来，这使得它们能够通过互补核苷酸配对进行高度特异性的检测。核酸诊断已经成为各种急慢性疾病的金标准，特别是那些传染病。在传染病爆发期间，正如最近经历的2019年冠状病毒病COVID-19大流行一样，快速准确的核酸检测对有效控制疾病至关重要。核酸生物标记物的检测对农业和食品安全、环境监测和生物试剂的检测也至关重要。

以定量聚合酶链反应qPCR或测序为基础的核酸诊断已被广泛采用，并经常用于临床实验室。PCR技术的多功能性、稳健性和敏感性使其成为DNA和RNA生物标记物检测中最常用的技术。事实上，PCR是大多数核酸诊断的金标准技术。然而，PCR技术使用的试剂成本高，需要先进的实验室设备和训练有素的人员。尽管等温核酸扩增不需要热循环，但非特异性扩增可导致较低的检测特异性。特异性可以通过增加读取数来提高，特别是通过荧光探针、寡链置换探针或分子信标。然而，这需要一种技术将等温扩增的易用性和成本效率与PCR的诊断准确性相结合起来。理想情况下，这种新一代诊断方法还应具有单核苷酸特异性，这对于检测赋予抗生素或抗病毒药物抗性的突变是不可或缺的。

基于CRISPR技术的诊断方法有可能满足这些需求。CRISPR系统是微生物适应性免疫系统的基本部分，其基于其序列识别外源核酸，随后通过与CRISPR Cas蛋白酶相关的内切核酸酶活性消除它们。尽管在不同种类的古细菌和细菌中存在不同的CRISPR-Cas系统，这些系统通过它们对 CRISPR RNA (crRNA) 的依赖而相互连接，后者引导 Cas 蛋白识别和切割核酸靶标。通过与互补序列杂交，crRNA 可以针对特定的 DNA 或 RNA 区域进行编程。在某些系统中，该序列**于原始间隔区相邻基序 (PAM) 或原始间隔区侧翼序列邻近。到目前为止，CRISPR-Cas系统已被定位于多种应用，包括基因组，表观基因组和转录组的靶向编辑，核酸的生物成像，细胞事件的记录和核酸的检测。总体而言，CRISPR的诊断的快速发展是建立在CRISPR技术的特异性、可编程性和易用性的基础上，旨在创建基于核酸的即时 (POC) 诊断测试，用于常规临床关心。

来自美国哈佛大学的James J. Collins教授和他的团队对CRISP技术在检测方面的应用有着深入的研究，美格君希望James J. Collins团队的研究经验和总结可以给大家带来一些启发。

该篇概述了如何将不同的CRISPR Cas酶的特性用于诊断检测，探讨了不同的预扩增策略（目前构成大多数基于CRISPR的诊断检测的一部分），研究定量和多路复用的方法，重点介绍结合 CRISPR 的技术-基于测序的目标富集，并审查针对 POC 应用的基于 CRISPR 的诊断的优化，重点是检测读数和样品制备。文章还概述了该技术的新兴生物医学应用，并讨论了挑战和机遇。

基于CRISPR的检测诊断方法

自从最初发现以来，不同CRISPR/Cas系统的数量迅速增加。目前，根据进化关系，CRISPR Cas系统可以分为两类系统，六种类型和几种亚型。CRISPR-Cas系统的类别由核糖核蛋白效应复合物的性质定义：第1类系统的特征是多种效应蛋白的复合物，第2类系统则包含单个crRNA结合蛋白。CRISPR诊断中使用的不同效应蛋白的crRNA设计遵循与其他CRISPR应用相同的原理，并总结在表1中。在不同的CRISPR系统中，2类系统主要用于诊断，因为这些系统重构更简单。它们包括具有附带活性的酶，这是许多基于CRISPR的诊断检测的关键（表2）。1类系统（例如III型效应核酸酶Csm6或Cas10）也已被设计用于诊断，无论是在与第2类系统的组件的组合或与天然III型复合。

表1 CRISPR诊断技术中crRNAs的设计原则

表2   各种CRISPR诊断技术的特点比较                          (From James J. Collins et al.)

人们开发的**种基于CRISPR的诊断方法主要使用识别双链DNA（dsDNA）的CRISPR Cas9变体。已经有许多不同的基于Cas9的DNA检测方法。

图1 NASBACC、SHERLOCK、DETECTR技术比较            (From James J. Collins et al.)

左图：RNA 靶标通过 NASBA 扩增，从逆转录 (RT) 到互补 DNA 开始，使用序列特异性引物附加触发序列（洋红色）以用于立足点传感器。RNA/DNA 杂交体的 RNA 被 RNase H 破坏，使含有 T7 启动子的引物能够结合并产生互补的第二条 DNA 链。dsDNA 模板的 T7 转录产生目标 RNA 序列，该序列可用作新 NASBA 循环的起始材料或由立足点传感器检测。如果 dsDNA 扩增子中存在 PAM 序列（蓝色），则 Cas9 介导的切割会导致 T7 转录的模板被截断，从而生成更短的目标 RNA，无法激活立足点传感器。在没有 PAM 序列的情况下，一个包含触发器的全长目标 RNA 被转录，这会激活脚趾传感器并产生可见的颜色变化。右图：分别通过 RPA 或 RT-RPA 扩增 DNA 或 RNA。对于靶向 RNA 的 CRISPR 酶（包括 Cas13a），扩增的 RPA 产物通过 T7 转录为 RNA。crRNA 与互补靶序列的结合会激活 Cas 酶并触发淬灭荧光报告基因的附带裂解。因此，Cas13a（用于 SHERLOCK）或 Cas12a（用于 DETECTR）分别表示 RNA 或 DNA 靶序列的存在。crRNA 与互补靶序列的结合会激活 Cas 酶并触发淬灭荧光报告基因的附带裂解。因此，Cas13a（用于 SHERLOCK）或 Cas12a（用于 DETECTR）分别表示 RNA 或 DNA 靶序列的存在。crRNA 与互补靶序列的结合会激活 Cas 酶并触发淬灭荧光报告基因的附带裂解。因此，Cas13a（用于 SHERLOCK）或 Cas12a（用于 DETECTR）分别表示 RNA 或 DNA 靶序列的存在。

CRISPR Cas9诊断检测方法的主要原理：

通过催化失活的Cas9配偶体，根据向导指引，重组分裂的蛋白，利用Cas9破坏含PAM的位点，用Cas9诱导非靶向DNA链进行解旋，并作为等温扩增的靶向位点。这种基于Cas9的方法，称为NASBACC，用于基于核酸序列的扩增（NASBA）-CRISPR切割。这种方法结合了用于靶标的核酸序列的等温预扩增、用于PAM依赖性靶标检测的Cas9切割、用于读出的toehold传感器（图1，左）。简单地说，toehold触发装置连接至NASBA扩增的RNA片段。如果PAM序列存在于RNA片段中，不用触发序列，Cas9介导的切割可以形成截短的RNA。在没有PAM序列的情况下，含有全长RNA的触发器激活toehold开关，如颜色变化所示。通过检测菌株特异性PAM位点，该方法允许区分病毒谱系，如在低飞摩尔浓度范围内检测被感染的猴子血浆中的寨卡病毒ZIKV所示。最近，一种称为LEOPARD的基于Cas9的方法，利用工程改造的tracrRNA和目标DNA进行PArallel RNA检测，能够多重检测具有单核苷酸特异性的不同RNA序列。该方法基于以下观察结果：在II型系统中形成Cas9-crRNA复合物所必需的反式激活crRNA（tracrRNA）与细胞RNA杂交，形成“非经典”crRNA。通过重新编程tracrRNA，以结合相关的细胞转录物，同时允许形成Cas9-crRNA复合物，得到的非经典crRNA能够将Cas9引导至DNA靶标。

CRISPR Cas9检测系统与CRISPR Cas12、CRISPR Cas13系统的区别

CRISPR II型 Cas9系统与CRISPR V型 Cas12系统 和VI型 Cas13系统之间的主要区别在于后两种系统能够触发靶标识别上的非特异性附带切割（反式切割）。附带活性涉及Cas12蛋白对非靶向单链DNA的切割，或Cas13蛋白对单链RNA的切割。它能够通过信号放大来感测核酸，并通过添加功能化的核酸报告子来实现各种读数，这些核酸报告子被附带活性切割。CRISPR-Cas VI型Cas13酶家族的大小范围为约900-1300个氨基酸，以顺式构象检测ssRNA，并在体外显示出针对ssRNA的附带反式切割活性。在基于CRISPR Cas13的SHERLOCK检查中，首先分别用重组酶聚合酶扩增（如：RPA）或逆转录RPA（RT-RPA）等温扩增DNA或RNA，使用正向引物向扩增子添加T7启动子（图1，右）。该启动子允许靶标的RNA转录。然后，靶标被LwaCas13a和包含与靶标互补序列的crRNA的复合物识别和结合。活化的Cas13将通过顺式切割靶标RNA，并以靶标依赖性方式，通过附带反式切割ssRNA报告分子。ssRNA报告分子由荧光团和通过短RNA寡聚体连接在一起的猝灭剂组成，一旦被切割，荧光团就与猝灭剂分离，产生荧光。这些过程可以检测病毒RNA、细菌DNA、人类单核苷酸多态性（SNPs）和癌症相关突变，灵敏度达到attomolar（10-18 M） 。第二版本的SHERLOCK v2技术可以对核酸进行定量多重检测，浓度在zeptomolar（10-21 M）级别，并引入了基于免疫层析测定法，通过纸条上的抗体缀合的金纳米颗粒检测切割的报道分子。

Cas12酶已经用于靶向dsDNA和ssDNA的CRISPR诊断，它需要在靶区域中的PAM位点，用于dsDNA切割和附带切割ssDNA。2018年，人们发明了**种基于CRISPR/Cas12的检测方法，称为DETECTR。在该方法中，来自细菌Lachnospiraceae的LbCas12a，或其他生物的Cas12a，通过互补的crRNA被引导至dsDNA靶标，触发携带荧光团和猝灭剂的短ssDNA报道分子的附带切割。与SHERLOCK类似，靶标识别和报告基因切割导致猝灭剂与荧光团分离，从而产生荧光信号。当与RPA或RDA恒温扩增技术结合时，DETECTR可以达到zeptomolar敏感级别。其他基于Cas12的技术包括HOLMES，以及LbCas12a和HOLMES v2，使用PCR作为预扩增，它使用环介导的等温扩增LAMP技术与来自Alicyclobacillus acidoterrestris（AacCas12b）的热稳定Cas12b在一管中反应。HOLMES和HOLMESv 2的检测限都在10aM左右。类似地，Cas12f靶向dsDNA和ssDNA，但是能够比Cas12a更好地区分ssDNA中的SNP。

无需预先扩增的诊断方法

当使用CRISPR Cas蛋白酶而没有对靶标的进行上游预扩增时，大多数基于CRISPR诊断方法报告的LOD在皮摩尔picomolar范围内。当样品中存在相对高浓度的DNA或RNA时，该LOD标准允许进行靶标检测。例如，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）在感染早期浓度高（约6.76 × 10⁵拷贝/每个拭子），可以进行无扩增检测。

除了高度浓缩的微生物样品之外，人类基因组DNA（gDNA）和高度表达的人类信使RNA和小RNA（miRNA）可以在没有预扩增的情况下进行检测。

为了提高无扩增CRISPR诊断的灵敏度，人们将LwaCas13a与CRISPR III型RNA核酸酶Csm6结合。Csm6的核酸酶活性被环状寡腺苷酸（2'，3'-环状磷酸基团）激活。由于LwaCas13a和PsmCas13b的附带切割活性产生具有羟基化5'末端和2'，3'-环磷酸末端的产物，因此人们认为Cas13的附带活性可以产生Csm6激活剂，从而实现放大信号检测。与LwaCas13a对UU和AU双碱基基序的切割偏好相反，人们发现来自意大利肠球菌（EiCsm6），唾液乳杆菌（LsCsm6）和嗜热栖热菌（TtCsm6）的Csm6对富含A和富含C的报告子有很强的切割倾向，可以在不同通道中独立测量LwaCas13a和Csm6的切割活性，并进一步设计“受保护的”RNA激活因子。这些激活因子被设计成包含一个poly（A）Csm6激活因子，跟着一个poly（U）拉伸，其基础原理是LwaCas13a的附带切割只会降解尿苷，从而产生具有2′，3′-环磷酸酯末端的六腺苷酸和活化Csm6。活化的Csm6将依次切割另外的报道分子，释放猝灭的荧光团，从而增加信号。与单独的Cas13a相比，当在同一通道中读取Csm6介导的荧光和Cas13a介导的荧光时，该设计导致信号灵敏度增加3.5倍。类似地，在III型系统中，从天然Cas10酶产生环状寡腺苷酸，已被用于检测SARS-CoV-2基因组。

我们需要更多提高无扩增CRISPR诊断灵敏度的策略。这包括Cas酶介导的适体，或酶抑制核酸接头（例如小牛肠碱性磷酸酶或荧光素酶）的降解，然后可以通过比色或发光方法检测。

预扩增方法

与适用于无扩增CRISPR诊断的应用相反，大多数临床设备要检查的浓度低于皮摩尔范围。一个例子是在抗病毒治疗下检测人类免疫缺陷病毒（HIV）或丙型肝炎病毒（HCV）负荷。因此，迄今为止报道的基于CRISPR的诊断在很大程度上依赖于靶标的预扩增。尽管一些研究使用PCR，但由于仪器要求更简单，等温扩增技术与POCT的使用更加合适。其中一些扩增方法接近环境温度（如RPA/RDA，37-42°C），但其他方法则需要加热装置（例如：NASBA，40-55 °C；LAMP，60-65 °C；链置换扩增SDA，60 °C；解旋酶依赖性扩增HDA，65 °C；指数放大反应EXPAR，55 °C）。在基于CRISPR的诊断中，最常用的等温扩增方法是RPA和LAMP。最初，SHERLOCK和DETECTR使用RPA进行预扩增，其灵敏度高于NASBA。尽管非特异性扩增在挑战常规RPA，但基于下游crRNA的靶标检测提高了特异性。RPA引物的设计不如LAMP引物的设计复杂，但是如何可靠地采购单个供应商的专有酶混合物一直是一个难题。此外，添加大分子拥挤剂（例如聚（乙二醇））、低的反应温度等降低了试剂的混合程度，需要混合步骤来扩增低丰度靶标。

通过将AacCas12b与LAMP组合，可以使用HOLMESv2进行一管检测。在COVID-19大流行期间，逆转录酶LAMP扩增技术RT-LAMP已被广泛用作等温预扩增技术。

使用RT-LAMP，比RPA中使用的操作温度更高，能够提高扩增的特异性，并且必需的酶和试剂都有商业化产品，其可用性有助于规划和执行实验。LAMP引物的设计可能很复杂，但在线工具可以帮助实现这种扩增技术。

量化策略

在许多临床环境中，需要准确定量生物标志物浓度，特别是要用当量的变化来表明治疗功效的时候，例如在抗病毒治疗期间，监测病毒载量变化。对于PCR，定量可以是绝对的或相对的。在绝对定量中，根据已知的浓度标准进行连续稀释，以获取标准曲线，其用于确定未知样品中的目标浓度。在通常用于确定差异表达基因的相对定量中，目标浓度的表达与参考指标相关。

在基于CRISPR的诊断中，通过与标准曲线的比较，可以在皮摩尔至微摩尔范围内（10^-12 M到10^–6 M）获得绝对定量 ，其中基于CRISPR的附带切割活性与目标浓度相关。然而，临床上有用的检测通常需要较低的LOD，因此需要预扩增。在双管反应中，预扩增期间的饱和会阻碍定量读数。对于结合了预扩增和基于CRISPR的检测的一管反应，附带切割与靶标扩增同时发生。这使得实时读取能够在连续测量信号时进行量化。

然而，它需要更复杂的实验室设备（类似于qPCR），这通常不适用于POCT测试。为了便于在两管反应中定量，可以使用较低的RPA引物浓度来防止预扩增反应饱和。

在SHERLOCK v2协议中，在attomolar到picomolar范围内（10^-18 M到10^-12 M），240nM的引物浓度可以让RNA输入浓度和输出信号相关 。定量的其他选项包括与已知标准品相比未知样品连续稀释的可能性。使用适用于POCT的设备实施这些不同的量化解决方案可能是基于CRISPR的诊断技术研究的主要焦点。此外，控制核酸制剂的质量和样品采集，或加工过程中引入的任何抑制成分（如肝素，过量盐，尿素，血红素，离子洗涤剂，醇和酚类），对于基于CRISPR的诊断很重要，以期达到目前诊断PCR方案的临床应用标准。

检测多个目标的策略

许多诊断设备需要对多个目标进行全面和同时的测试（多路复用），因为它可以实现更高的吞吐量和更低的单目标成本，提供更多信息。基于PCR的核酸检测可通过在一个反应中同时扩增不同靶标，并结合每个扩增子的特异性检测，来进行多路复用，或通过并行读出多个单独的反应。最初设计基于CRISPR的多重诊断利用了不同Cas酶对不同核酸报道序列的附带切割活性的特异性。这可以在一次测定中通过Cas酶检测多个核酸靶标。特别的，SHERLOCK v2通过包括四个报告分子设计，能够在一个多重反应中定性检测多达四个不同的靶点，这四个报告分子设计是针对PsmCas13b，LwaCas13a，CcaCas13b和AsCas12a。多路Cas13检测可以与多路预放大（使用RPA）相结合，允许同时检测两个不同的目标（图2，左）。在单个反应中，超出这些水平的额外的多重作用受到预放大化学的限制。

图2 基于多路复用的CRISPR检测方法                                      (From James J. Collins et al.)

左图：在 SHERLOCKv2 中实现的最多四个目标的池化复用。正交 CRISPR 酶（PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b、AsCas12a），每个酶优先切割带有不同荧光团（FAM、TEX615 (TEX)、Cy5、六氯荧光素 (HEX)）的不同报告分子，具有不同的吸光度和发射波长。右图：在 CARMEN 中，每个 PCR 扩增样本或基于 Cas13 的检测混合物都添加了不同的颜色代码。基于 Cas13 的检测混合物包含 Cas13a、序列特异性 crRNA 和裂解报告基因。颜色编码的溶液在氟油中乳化，产生纳升液滴。来自所有样品和检测混合物的液滴汇集在一起，并一步加载到微孔阵列芯片中，以创建所有可能的成对组合。每个孔中的液滴对在它们通过暴露于电场合并之前使用荧光显微镜进行识别。然后使用荧光显微镜来监测每个基于 Cas13 的检测反应。

基于CARMEN-CRISPR的多重检测技术可以同时检测4500多个靶点。该方法建立在SHERLOCK的反应基础上，但使用了一个小型化的反应体积（图2，右）。在CARMEN中，扩增的核酸靶样品和LwaCas13检测混合物分别与基于不同溶液的色码相结合。颜色编码的溶液在含氟油中乳化，产生纳升大小的液滴进行输入。来自所有样品和检测混合物的液滴汇集在一起，随后加载到微加工芯片上，以产生所有可能的样品和检测液滴成对组合（每孔一对）。然后，通过施加外部电场来合并液滴对。在特定微孔中对两个液滴的染料的初始记录会显示里面是哪种样品和检测液滴，并且通过Cas13a触发的报告子切割，在目标检测时产生的荧光指示阳性反应。这种小型化加上Cas13a的高灵敏度和特异性，成功地进行了169种人类相关病毒的检测、冠状病毒和甲型流感病毒株的亚型鉴定以及抗药性HIV突变的鉴定。与传统的DNA微阵列相比，CARMEN不需要耗时的探针点样，并且比PCR具有更高的可扩展性。尽管CARMEN需要一个预放大步骤、显微镜分析和熟练的实验室人员，但它可以进行快速、高通量和低成本的病原体检测。由于检测反应的小型化，CARMEN大大降低了试剂成本和样品消耗。然而，它目前对先进显微镜的依赖使其**于在资源丰富的实验室环境中使用。

CRISPR-Cas系统与高通量测序的结合

因为基于测序的诊断技术使用读数与生物信息学数据库的比对来鉴定病原体，因此它们可以容忍目标生物基因组的可变性，并且不一定需要事先了解靶序列。当病原体未知或其基因组快速进化时，这些特征特别有用。然而，为了检测低丰度病原体，在测序之前富集相关的序列区域变得必要。基于 PCR 的测序区域扩增有几个限制，包括去除表观遗传标记，扩增偏倚以及与富含GC的区域或非常大的区域的扩增相关的挑战。较大的扩增子对于长读测序技术（例如纳米孔测序）特别感兴趣，因为它们允许表征远程结构变异。

为了克服这些限制，有些方案在测序之前使用Cas核酸酶来富集相关的区域。

例如，纳米孔Cas9靶向测序（nCATS）使用Cas9切割染色体DNA以连接用于纳米孔测序的衔接子（图3，左），使得能够在保持表观遗传标记的同时对高深度的长片段进行靶向测序。这项技术允许同时检测CpG甲基化，结构变异和单倍型分辨单核苷酸变异，仅仅用3 微克的基因组DNA，它通过MinION flow cell实现了675倍的覆盖率，并通过Flongle flow cell 实现了34倍的覆盖率。为了避开对基于PCR的富集的需求，人们开发了STRique技术，用于通过纳米孔测序鉴定短串联重复序列（STR）（图3，左）。

除Cas9外，Cas12a还用于诱导含有重复序列的区域旁边的DNA切割，然后连接衔接子进行纳米孔测序。该方法使用识别STR侧翼区域位置和STR数量的算法，能够检测来自脆性X综合征患者和肌萎缩侧索硬化患者的细胞系中STR扩增以及CpG甲基化状态。

图3   用于测序诊断的CRISPR-Cas富集方法

左图：nCATS 是一种基于 Cas9 的富集技术，它首先使 DNA 末端去磷酸化，然后使用 Cas9 在包含 PAM 序列的感兴趣区域 (ROI) 附近诱导切割。具有 N 端截断的 DNA 聚合酶 I 缺乏核酸外切酶活性（Klenow 片段），能够将 dAMP（脱氧腺苷单磷酸 (dA)）添加到 DNA 片段的 3' 端（d(A)-加尾）。接下来，包含马达蛋白的接头在 Cas9 切割位点与 DNA 连接，使 DNA 能够通过纳米孔。STRique 使用 Cas12a 富集通过纳米孔测序分析的含重复区域，并采用算法来识别重复侧翼区域的位置和重复次数。右图：DASH 在下一代测序之前使用 Cas9 去除不需要的序列（黑色）。

CRISPR-Cas系统还与下一代测序NGS相结合，以提高测序产量。例如，开发了DASH,depletion of abundant sequences by hybridization,用杂交的方法，消除不需要的东西达到富集的效果。在该方法中，crRNA文库将Cas9引导至不需要的靶序列，用于切割，并且非靶向区域保留扩增和测序所需的完整衔接子（图3，右）。

另一种方法FLASH，finding low-abundance sequences by hybridization，通过杂交发现低丰度序列，包括通过磷酸酶阻断gDNA，利用与一组靶向相关基因的crRNA组合的Cas9消化gDNA，然后连接衔接子，以及利用扩增和测序的方法。利用这种技术，人们在呼吸液和干血斑中检测到亚摩尔水平的耐药革兰氏阳性菌和疟疾寄生虫恶性疟原虫。

POCT和现场应用的分析优化

数据读取

为了可视化的测量Cas酶对靶标识别的活动情况，一些策略已经采用适用于POCT或现场应用的快速和低成本的读取方法。使用具有不同性质的报道分子能够实现各种各样的数据读取，包括荧光，侧流免疫色谱和电化学。对于基于荧光的测定，大多数基于CRISPR的诊断方法利用携带荧光团和猝灭剂的RNA或DNA报告分子。目标检测中的附带切割活性导致荧光团和猝灭剂的空间分离，并且可以在常规平板阅读器、低成本和便携式设备、甚至用肉眼读取蓝光数据。有的策略通过使用通过ssRNA或ssDNA寡核苷酸连接的金纳米颗粒实现比色可视化。Cas12介导的或Cas13介导的针对连接体的反式切割导致金纳米颗粒与识别的靶标分离，在溶液中产生鲜艳的红色。或者，Cas介导的生物素化ssDNA底物的切割导致DNA-金纳米颗粒的磁性的降低。基于核酸和正电荷聚电解质液-液相分离的浊度分析也可以提供视觉读数。在这种情况下，附带切割导致用于目标识别的核酸聚合物降解。这可以在与聚阳离子互补后观察到，当溶液在发生裂解时保持澄清，在没有靶触发裂解时浑浊。

图 4. 侧向流动分析

左上角：荧光读数依赖于淬灭的荧光团，在识别目标时，由于连接荧光团和淬灭剂的 DNA 或 RNA 寡聚体的附带裂解而被释放。信号可以通过荧光读取器测量或在蓝光下通过眼睛读取。LED，发光二极管。右上角：基于侧流的免疫层析读数依赖于链霉亲和素和生物素的高亲和力，并使用由与 FAM 和生物素结合的 DNA 或 RNA 寡聚体组成的报告分子。CRISPR 反应的产物沉积在测试条的样品应用区域，此时 FAM 与金纳米颗粒标记的 FITC 特异性抗体结合。当完整时，报告寡聚体仍然通过生物素与链霉亲和素线结合，在测试条上形成一个色带。当报告寡聚体被切割时，FAM 和结合的金标记的 FITC 特异性抗体在条带上流得更远，并与二级抗物种抗体结合，从而形成第二条色带。左下：基于电流检测的电化学读数电化学电池中的H2O2。抗荧光素抗体（绿色）与葡萄糖氧化酶 (GOx) 结合，与携带 FAM 的 RNA 报告分子结合，这些分子通过生物素固定在表面。由于激活的 crRNA/Cas13a 复合物在目标识别时切割 RNA 报告分子，从而从表面释放携带 GOx 的抗荧光素抗体，因此在存在 RNA 触发器时，GOx 的浓度会降低。右下：在存在 dsDNA 触发器的情况下，Cas12a 在水凝胶中同时切割 ssDNA 接头。这可以防止水凝胶内的交联，从而调节纸基微流体装置的渗透性并允许缓冲液流动，这可以通过电测量。

横向侧流分析为以CRISPR为基础的诊断提供了许多简单的可视化途径。例如已经广泛使用的商用系统Millenia 1T。在该技术中，在试纸的样品垫区域，携带生物素和荧光素（荧光素酰胺FAM）的报告分子结合与金纳米粒子偶联的抗异硫氰酸荧光素FITC抗体。

这些复合物随后移动到链霉亲和素捕获线，在那里它们与报告分子的生物素结合。

在没有靶标的情况下，未切割的报告分子被保留在那里，这被视为条带上的一条带。

在靶标存在的情况下，Cas酶介导的报告子附带切割，将生物素从结合到抗FITC金纳米颗粒的FAM分子中分离出来，使它们在条带上走得更远，并在抗体捕获线上产生第二个可见条带，该条带带有物种特异性二级抗体。另一种基于附带切割的靶点检测方法是将基于Cas9的扩增子检测与使用基于crRNA锚定的杂交分析的横向流读数相结合。

携带电子读取设备的CRISPR诊断方法。一种叫做CRISPR-Chip的方法，它将失活的Cas9与靶向特异性crRNA复合，并固定在石墨烯场效应晶体管上。当结合到靶标的时候，石墨烯导电性的改变导致晶体管的电特性发生变化，这可以用电流的变化来衡量。

值得注意的是，这项技术不需要标记的报告分子，并且可以在杜氏肌营养不良症患者未扩增的gDNA样本中检测到肌营养不良蛋白基因的缺失。系统的灵敏度达到飞摩尔级1.7fM。另一种电子读取的策略，称为E-CRISPR，涉及一个带有亚甲基蓝电化学标记和巯基的单链dna裂解报告子，用于固定在金电极上。在该方法中，在检测到靶标时，Cas12a介导的附带切割通过释放亚甲基蓝导致电化学电流减少，而由于完整的亚甲基蓝携带报告子，当靶标缺失的时候，会导致高的电化学电流。该方法检测人乳头瘤病毒和细小病毒B19的DNA，LOD约为50pM, 可用于蛋白质检测。另一种方法使用电化学生物传感器检测Cas13a介导的携带FAM和生物素的RNA报告子的附带切割活动（图4，左下）。在这种方法中，葡萄糖氧化酶偶联的抗FAM抗体与固定在传感器上的报告分子的结合催化了葡萄糖的氧化。然后使用带有铂工作电极、铂对电极和银/氯化银参比电极的电化学电池对产生的H2O2进行电流检测。这种技术可以在4小时内，体积小于0.6μl的条件下，检测到LOD为10pM的miRNAs，该LOD是通过单独的“off-chip”切割实现的；一体式传感器的LOD为2.2nM。基于Cas13a的miRNAs电化学检测也可以用便携式电化学发光芯片显示（报道的检测限LOD为1fM）。在这项技术中，miRNA介导的Cas13a活化导致触发指数等温扩增的附带切割。扩增产物与Ru(phenanthroline)₂dipyridophenazine]²⁺形成了复合物，复合物在双极电极的阳极氧化，产生了与目标miRNA浓度成正比的电化学发光信号。

DNA水凝胶可以让CRISPR诊断方法通过通过改变其材料性质来实现诊断读取。

水凝胶由含有DNA分子的充水聚合物组成，DNA分子在凝胶中起了锚定或结构元件的作用（图4，右下角）。在靶识别时，Cas12a触发DNA分子的附带分裂，从而改变凝胶的性质。将该技术应用于检测病原体衍生的核酸，在多层纸基微流控装置（μPAD）中实现数据的可视化和电子读取。在没有靶标的情况下，含有DNA连接体的水凝胶阻碍了缓冲液通过纸基装置的多孔通道的流动。靶标识别导致Cas12a介导的连接体破坏，从而防止了水凝胶交联，并导致通过多孔μPAD通道的可见流动。这项技术可以检测到低至400pM的双链dsDNA，无需前置放大。为了产生电子读数，在μPAD的底层放置了两个电极。由于凝胶的导电性取决于其交联程度，Cas12a介导的裂解导致的低水平交联, 导致含有电解质的缓冲液流动，而在没有任何靶点的情况下，高水平交联阻止缓冲液流动，从而阻止了对电信号的记录。此外，在μPAD中加入无线射频识别（RFID）模块可以实时监控不同地理位置的目标检测。为此，Cas12a介导的靶检测附带切割导致环形RFID标签中的叉指电极排列短路，这增加了相对于参考RFID标签的接收信号的强度。

样品制备

要提高基于CRISPR的诊断方法在现场应用和POCT设备中的可用性，样本处理是一个至关重要的考虑因素。基于CRISPR的诊断方法最初使用合成靶点、或耗时、或设备密集型核酸分离协议。最近的研究旨在快速、无需设备地分离DNA或RNA。重要的是，样品提取步骤中使用的试剂不得干扰任何下游预放大步骤或基于CRISPR的目标检测。在许多情况下，最终读数是基于附带切割活动，必须采取特别的预防措施，以确保没有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，这些酶会切割ssRNA或ssDNA报告子。

最初的SHERLOCK方案表明，在含有磷酸盐缓冲盐水的裂解混合物中使用0.2%Triton X-100，并在95℃加热5分钟，可以直接处理唾液样本。这种粗制的唾液混合物用于SHERLOCK反应，进行基因分型。为了扩展到其他样品类型，HUDSON方案（用于加热未提取的诊断样品，以消除核酸酶）通过加热和化学还原使核酸酶和病毒失活，化学还原方法是，以100mM的最终浓度添加三（2-羧乙基）膦盐酸盐tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride，以1mM的最终浓度，添加乙二胺四乙酸ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)。针对不同的目标和样品类型，对不同的加热步骤（从5 分钟到20分钟，从37 °C至95 °C）进行优化。HUDSON协议能够通过CRISPR–Cas13a检测RPA预扩增靶点，包括检测血液、血浆、血清、唾液和尿液中的ZIKV和登革热病毒。由于HUDSON方案不足以灭活用于检测疟原虫物种的核酸酶（通过假阳性样品的比列观察），因此开发了含有更强螯合剂的制备缓冲液（20%w/v Chelex100 TE缓冲液，含二硫苏糖醇（DTT），浓度50nM）。

市场上的快速DNA提取液（例如QuickExtract，Lucigen）可以快速制备RNA，通过RT–qPCR检测SARS-CoV-2 RNA。鼻咽拭子与提取液混合，在95℃孵育5分钟 min，冷却后直接用于RT-qPCR反应。此分离方案与下游RT-LAMP预扩增和通过Cas12b（AapCas12b）检测兼容。当蛋白酶K在下游反应中被抑制剂阻断时，QuickExtract还能够在22℃、或60 °C下对样品进行裂解10分钟。

大规模测试和成本

CRISPR诊断分析的一个优点是它们无需复杂和昂贵的实验室设备，使用常见试剂（如PCR主混合物）。由于Cas蛋白酶和crRNAs可以快速大规模生产，基于CRISPR的分析较少依赖于供应链。然而，尽管用作crRNA合成模板的缓冲液、引物和寡聚物的成本可以忽略不计，但是基于CRISPR的分析包括比PCR更多的酶，尤其是当包括等温扩增步骤时。在实验环境中，单个CRISPR预放大诊断反应的成本约为每个反应0.61美元。在这些成本中，恒温扩增RDA/RPA试剂所占比例**。**个商业化的基于CRISPR的SARS-CoV-2诊断分析，包括RT-LAMP作为前扩增，目前每反应成本是30.15美元。目前尚不清楚，在更多的测试获得批准后，价格将如何发展，以及CRISPR–Cas蛋白检测核酸方法的专利将如何影响这项技术的传播。

大多数基于CRISPR的诊断分析使用液体试剂，这提供了实验灵活性。然而，储存crRNA、裂解报告蛋白和Cas蛋白的溶液通常需要保持超低温的冰箱。这些成分和预放大试剂的冻干消除了对冷链的依赖，并且通过使用更高的样品输入体积，分析灵敏度可以与使用非冻干反应的灵敏度相似甚至更高。人们需要对基于CRISPR诊断的成分进行系统的稳定性测试，临床队列研究和每日实验变量评估表明，分析结果具有高度的可重复性。

生物医学应用

基于CRISPR的诊断技术已被广泛应用于生物医学领域，特别是用于检测以核酸为基础的传染病和非传染病的生物标志物，以及检测遗传病的突变和缺失。此外，这项技术已被用于蛋白质和小分子的检测。

传染病

基于CRISPR的诊断的主要焦点是病原体的检测；尤其是病毒、细菌和寄生虫的DNA或RNA。以CRISPR为基础的方法检测到的RNA病毒包括细小病毒B19、黄病毒科（登革热、Zika和日本脑炎病毒等）、埃博拉病毒和冠状病毒科（在COVID-19大流行期间自然成为主要关注焦点）。

基于SHERLOCK的SARS-CoV-2检测最初包括两步分析，包括预先等温扩增，然后是T7转录和Cas13a介导的靶识别。该方法已在qPCR验证的临床队列中进行了测试，其中154个样本通过横向流动和荧光读数分析，380个PCR阴性样本仅通过荧光分析。该方法的检测限为每个反应42个RNA拷贝，当使用荧光和横向流动读数时，灵敏度分别为96%和88%。两个读数均为100%特异性。2020年5月，使用RT-LAMP而不是RT-RPA的改良SHERLOCK两步分析法获得了美国食品和药物管理局的紧急使用授权，用于基于CRISPR的SARS-CoV-2检测。使用该分析法的测试旨在定性检测上呼吸道样本中的SARS-CoV-2，并只限于《临床实验室改善修订规例》所授权的实验室。另一种基于Cas13a的检测方法SHINE（用于SHERLOCK和HUDSON整合以控制流行病）将预扩增反应和基于CRISPR的检测结合到一个单步反应中，利用HUDSON加速鼻拭子和唾液样本中SARS-CoV-2病毒的提取。RNase H (Magigen RNase H2)的加入、缓冲液的优化、镁和引物的浓度的优化以及polyU reporter和SuperScript-IV 逆转录酶的使用，将LOD降低到与两步分析相似的范围（用荧光读数为10拷贝/μl，用横向流动读数为100拷贝/μl）。该试验在50例鼻咽病人样本上进行了验证，对RT-PCR的敏感性为90%，特异性为100%。在另一种基于Cas13的方法中，整合多个crRNAs、使用来自 Leptotrichia buccalis (Lbu)的Cas13a同系物，测量荧光的变化，使从鼻拭子中提取的SARS-Cov-2RNA的检测限下降到1.27% × 10⁸ 每毫升拷贝数（Cas13反应中1.65 × 10³ 每μl的拷贝数）。重要的是，这是在不需要预放大的情况下实现的，并且该分析与使用便携式荧光检测设备的读出兼容。

利用Cas12a，人们优化了SARS-CoV-2两步检测法，用RT-LAMP，从拭子RNA提取物扩增开始，在不到40分钟的时间内检测到SARS-CoV-2基因组的N（核蛋白）和E（包膜小膜蛋白）基因，以及人类对照基因（核糖核酸酶P蛋白） 。与美国疾病控制和预防中心的RT-qPCR检测相比，SARS-CoV-2检测结果的阳性预测一致性为95%，阴性预测一致性为100%。Cas12a也用于SARS-CoV-2 AIOD-CRISPR（用于一体式双CRISPR–Cas12a）分析，该分析将Cas12a与一对非PAM依赖性crRNAs一起使用，每个crRNAs检测靶核酸扩增子的单独区域。将这些Cas12a-crRNA复合物引入预扩增试剂和裂解报告试剂的一管试验中。这种方法可以在每个反应中检测到5份合成的SARS-CoV-2rna，并在28份临床拭子样本中得到验证。STOPCovid（用于SHERLOCK一管试验），是另一种基于Cas12的一管试验，将基于RT-LAMP的预扩增与CRISPR介导的检测集成在一步工作流程中。在所研究的各种Cas蛋白中，Cas12b（AapCas12b）与来自AacCas12b的scaffold single guide RNA 一起，使试验能够在LAMP所需的温度范围内进行。STOPCovid的敏感性与RT-qPCR相当，每个反应的LOD为100个病毒基因组拷贝。

除RNA病毒外，DNA病毒如疱疹病毒科（包括巨细胞病毒CMV和爱泼斯坦-巴尔病毒）、多瘤病毒科（BK病毒BKV）和乳头状瘤病毒科（人乳头状瘤病毒）也已通过基于CRISPR的诊断检测到。特别是在临床应用中，已用SHERLOCK法检测CMV和BKV。该实验用qPCR法验证，从67例HUDSON分离血浆和尿液中检测到BKV，灵敏度和特异性分别为100%和100%。基于HUDSON的CMV血浆样品处理的灵敏度和特异性分别为80%和100%，而要通过硅胶膜纯化DNA，才能让灵敏度和特异性都达到100%。为了客观地评估横向流动分析的结果，人们开发了一个智能手机的软件应用程序来量化条带强度。侧流分析的背景信号与每天的实验变化、培养时间和温度无关，这有助于定性读数的重现。

CRISPR检测到的细菌包括结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、铜绿假单胞菌和肠炎沙门氏菌。CRISPR也被用来检测疟疾中的疟原虫。该方法检测所有已知可引起人类疟疾的疟原虫物种。人们使用冻干试剂，简化下游样品制备，利用RPA–Cas12a一管反应，开发了一种不同的CRISPR分析方法，用于检测恶性疟原虫。

加入逆转录酶将靶RNA转录到DNA中增加了检测的灵敏度。根据疟原虫种类的不同，该方案的检测限在每μl 0.36到2.4个寄生虫之间。

非传染性疾病

基于CRISPR的诊断技术也被开发用于检测与非传染性疾病相关的RNA物种。例如，基于CRISPR的人CXCL9 mRNAa检测，被用于检测急性细胞性肾移植排斥反应，按照肾活检所定义的，从31个尿细胞颗粒中分离的总RNA的敏感性为93%，特异性为76%。

基于CRISPR的诊断也被用于检测miRNAs，例如基于CRISPR/LwaCas13a的电化学检测未经预扩增的髓母细胞瘤患者血清样本中的miR-19b，以及使用CRISPR/LbuCas13a检测从乳腺癌细胞系分离的RNA中检测miR-17，以及用LbCas12a检测miR-21，在滚环转录之后。

SNP和缺失

基于CRISPR的诊断的主要优势是Cas酶的单核苷酸特异性，能够检测点突变和小缺失。单核苷酸特异性可以让CRISPR技术实现对抗微生物抗性、表皮生长因子受体基因中的缺失和突变、导致Duchenne肌营养不良症的突变以及影响眼睛颜色的E3泛素连接酶基因中的SNP的标志物的检测。CRISPR-Cas系统的单核苷酸特异性也被用于miRNA的检测，由于它们的尺寸短，并且它们只能相差一个碱基，因此其他技术难以检测。基于CRISPR的方法也可适用于检测SARS-CoV-2变体。

核酸以外的靶标

基于CRISPR的诊断方法已被用于检测蛋白质和小分子。在这些情况下，CRISPR系统主要用作报道分子或放大器，并且靶分子的实际检测是通过在靶识别上经历构象变化的蛋白质或适体介导。检测小分子的一种策略是将CRISPR-Cas12a与细菌变构转录因子（aTF）结合起来。该方法被称为CaT-SMelor（用于CRISPR-Cas12a介导的和aTF介导的小分子检测），用于检测纳摩尔浓度的尿酸和对羟基苯甲酸，以及检测人血中的尿酸样本。在这种方法中，将含有Cas12a靶序列的固定化aTF-dsDNA复合物与aTF靶小分子一起温育，让aTF中的构象变化，从而将dsDNA从复合物中释放出来。通过离心去除固定的aTF后，使用CRISPR–Cas12a检测游离dsDNA，并通过淬灭的荧光报告基因的附带切割，进行测量。SPRINT（用于基于SHERLOCK的体外转录分析）方法使用由特定效应分子触发的aTF和核糖开关来调节RNA靶标的转录。然后通过crRNA和Cas13a检测转录的RNA。这样能够感测多种效应分子（包括氟化物，腺嘌呤，鸟嘌呤，S-腺苷甲硫氨酸，黄素单核苷酸，血清素，锌和脱水四环素）。

另一种检测小分子的方法涉及含有Cas12a的ssDNA靶标的适体，其作为三磷酸腺苷（ATP）的传感器，报告的检测限为ATP 400nM。在这种方法中，ATP与适体的结合阻碍了靶标识别，从而减少了Cas12a触发的ssDNA报告基因的附带切割。或者，已经通过适体或DNA酶（也称为“功能性DNA”）检测到ATP或Na+离子，所述适体或DNA酶在与其非核酸靶标结合时释放Cas12a靶标，通过反式切割荧光报告分子，检测到Cas12a的活动。

同样，人们已经开发了一种基于适体的检测方法，用于基于CRISPR–Cas12a的转化生长因子β1（TGF-β1）蛋白的检测。在该方法中，TGF-β1与含有Cas12a靶位点的特定ssDNA适体结合。在不存在TGF-β1的情况下，所有游离和未结合的适体分子被Cas12a识别，其携带亚甲蓝的ssDNA报道分子的附带切割活性导致由E-CRISPR检测的电化学信号的减少。基于适体的E-CRISPR检测允许在临床样品中检测TGF-β1，LOD为0.2nM。

CLISA（用于基于CRISPR-Cas13a的信号放大连锁免疫吸附测定）被开发用于以2.29fM的浓度检测人白细胞介素-6，以0.81 fM检测人血管内皮生长因子。这是通过用含有T7启动子的生物素化dsDNA替换夹心型酶联免疫吸附测定（使用辣根过氧化物酶）的信号放大酶来实现的，其允许T7介导的Cas13a靶标转录，让其活化和附带切割报告子。

CRISPR检测技术展望

在不到五年的时间里，基于CRISPR的诊断技术已经从一种实验性的核酸检测工具发展成为一种临床相关的诊断技术，用于POCT快速、经济和超灵敏地检测生物标记物。

然而，这项技术需要克服一些困难，才能实现改变疾病诊断和新出现病原体监测方式的承诺。目前大多数基于CRISPR的诊断方法的一个主要缺点是，它们依赖于前置放大来检测飞摩尔级以下的目标。虽然用于预扩增的引物增加了一层特异性，但这一过程增加了分析的复杂性，增加了成本，延长了反应时间。非引物信号放大策略的加入，或着Cas酶、crRNA、报告分子的修饰，是潜在的改善途径。目前，大多数用于预放大的crRNAs和引物都必须经过实验测试，并且缩小潜在候选对象的设计规则是粗糙的。基于大规模实验数据集的机器学习和生物信息学算法可以开发更有效的设计工具，更好地预测crRNA的性能，提高crRNA的特异性和活性。事实上，在基因组工程的背景下，以及在toehold开关的表征和优化中，已经证明了这种方法用于crRNA设计的可行性。

通过优化一管反应，并让测试结果简单可视化的，基于CRISPR的诊断的易用性得到了改进。然而，样品制备仍然需要一个单独的步骤，培养温度高于室温需要加热装置。此外，要让分析结果接近LOD的目标浓度让定量读数具有挑战性，尤其是在使用横向流动格式时。对于在家中或现场使用场景，分析设计应结合简单的样品制备方案和稳健的检测方法，以在可变或具有挑战性的环境中提供稳健的结果，如长期储存、有限的用户培训和恶劣的环境条件下使用。为此，通过使用微流控技术，将样品制备、传感和报告集成在单一且易于操作的单元中的装置越来越成为可能。这种设备与数字分析和数据共享系统的结合，为以患者为中心的测试和远程数据访问带来了希望。这对于通过限制不必要的人与人接触来减少传染病的传播尤为重要。此外，CRISPR的诊断技术可以以患者为中心，伴随核酸诊断，能够监测药物的治疗反应，并将有严重不良反应风险的患者与可能受益于药物的患者区分开来。基于CRISPR的诊断可以促进对指示治疗反应的遗传标记物的监测，例如BRAF基因的突变，这通常用于指导黑色素瘤皮肤癌的治疗。此外，CRISPR诊断技术可用于通过检测无细胞mRNA，实时监测不同组织中的基因表达。

CRISPR诊断技术的未来应用可能涉及到与材料科学交叉的技术，用于固体表面、可穿戴设备和医疗设备上的核酸检测。例如，一项新的研究旨在将SARS-CoV-2传感器整合到面罩中，以便实时检测病毒。在表面上的直接检测可以利用传染源的局部的高浓度，并且可以连续跟踪和早期诊断。这可以扩大监测能力，例如利用厕所系统分析排泄物。

当然，新开发的CRISPR分析必须通过临床试验进行验证，并在临床实施后对分析有效性进行监控和维护。我们相信，CRISPR诊断技术的快速创新最终将重塑核酸检测的技术格局。

参考文献

Kaminski M M, Abudayyeh O O, Gootenberg J S, et al. CRISPR-based diagnostics[J]. Nature Biomedical Engineering, 2021, 5(7): 643-656.

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