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如何进行快速恒温扩增?RDA快速恒温扩增技术原理RDA, Recombinase Depend Amplification, 是以重组酶介导的快速等温扩增技术。 RDA 反应所需要的关键酶是能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶(KX)、DNA 单链结合蛋白(SSB)和链置换DNA 聚合酶(Bsu)。 RDA反应具体过程为: a. 首先,针对目标DNA片段设计一对正向和反向引物,重组酶KX与引物结合形成复合物,该复合物在双链DNA 模板中寻找靶位点; b. 一旦找到靶位点,复合物在模板上定位后可直接引发链交换反应形成D 状环,SSB 随即结合被置换的DNA单链,形成D-Loop 结构; c. 重组酶-引物复合物主动水解体系中的ATP 导致复合物构象改变而解离,重组酶解离后引物3'端暴露并被Bsu识别,Bsu按照模板序列在引物3'端添加相应碱基,DNA扩增反应启动; d. Bsu在延伸引物的同时,继续解开模板的双螺旋DNA结构,DNA 合成过程继续进行; e. 正反向两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子。在合成过程中,母板双链始终是分开的,正向和反向引物让链的合成从两个方向同时进行。该循环反复扩增进行,并最终导致要扩增的双链DNA的指数增加。
跟其他等温核酸扩增技术以及PCR技术相比,RDA恒温扩增技术主要表出以下5个优势: (1)RDA 技术拥有快速的反应效率,样本与试剂一接触便开始反应,不需要进行DNA 双链的变性裂解,在20 min 内得到检测结果; (2)RDA 反应在恒温下即可进行(37~42℃),不需要热循环仪进行核酸扩增,所需设备简单、经济; (3)RDA 技术可检测RNA、miRNA、ssDNA 以及dsDNA 样本,检测范围较广泛 (4)RDA 检测试剂盒操作简单,不需要复杂的技术培训; (5)RDA检测形式多样,可开发成为便携式核酸检测体系,用于现场快速检测。 利用RDA可以开发出低成本、高效、精准的POCT分子检测。RDA快速等温扩增技术有着巨大的发展前景。 在检测新冠状病毒COVID-19病毒的实验中,RDA检测到病毒的时间可以缩短到10分钟以内,灵敏度可以检测到少于10个拷贝的病毒,灵敏度达到临床的要求。 RDA、PCR、LAMP三种DNA片段体外恒温扩增技术比较
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