用改进的CRISPR Cas9基因编辑技术生产非转基因黄瓜

作者：Bowen Hu, Dawei Li, Xin Liu, Jingjing Qi, Dongli G来源：Cell

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用改进的CRISPR Cas9基因编辑技术制造非转基因全雌性黄瓜

全雌花性方法已在黄瓜育种中广泛利用。雌性系的应用可以更早的杂交生产，获得更高的产量，果实更集中。

此外，雌性系应用消除了手工去雄的需要，降低劳动成本。

因此，发展雌性自交系是黄瓜育种的好方法。

雌性自交可由雌雄同株自交系杂交选择产生，或可以自然变异自发产生。然而，这两种方法都有缺点。

例如费时费力的杂交过程，还可以导致不良的品性，而且雌性品种自然进化不一定是种植者所希望的。

CmWIPI作为心皮发育抑制剂，CmWIPI突变赋予一个雌性表型给甜瓜(Martin等人研究，2009).

修改黄瓜中的CmWIPI 同源基因，CsWIPI可促进雌性自交系的发展。

然而，黄瓜是棘手的改造。黄瓜转化低效率使得基因编辑工具如CRISPR Cas9‍蛋白的工作十分艰巨。

2016年Chandrasekaran等人首次将CRISPR Cas9基因编辑技术用于黄瓜。

为了提高黄瓜的遗传转化效率，对CRISPR Cas9基因编辑技术进行改进，在农杆菌介导感染及植株再生期间，用绿色荧光蛋白（GFP）作为标记。

子叶节为外植体，并沉浸在农杆菌溶液，随后共同培养3天。在感染的外植体，只观察到有微弱的GFP荧光，表明农杆菌感染不足。

受感染的外植体再生，产生负GFP芽和明亮的荧光，无法形成不定芽。

这一结果表明，农杆菌感染不能延伸到产生不定芽的细胞。

在叶腋中，表达分生组织标记基因的细胞SHOOT MERISTEMLESS (STM) 负责腋分生组织的起始。

原位杂交检测表明，生成外植体时，在U形切端深层细胞产生的芽中，CsSTM表达强烈。

我们推测，如果深层细胞被感染，可以获得转基因芽。

为了提高农杆菌感染度，以前采用真空渗透物理方法。然而，该方法尚未在黄瓜研究广泛采用，可能是因为使用繁琐。

在这个研究中，真空泵被一个简单的注射器替代。

共培养后，GFP荧光检测发现，真空渗透与浸泡，荧光信号的区域和强度不同。

在真空渗透下，GFP信号更强，在外植体的更深的细胞层中被发现。

真空渗透也增加了荧光外植体的频率。

再生培养基培养2周后出现GFP阳性芽。从外植体中分离出荧光芽，并拉长。

为了促进生根，低浓度的生长素被普遍使用。然而，额外的生长素似乎促进再生芽萎黄病，这可能是由于生长素刺激乙烯生产造成的。

转基因合成植物放在气候控制室。正如预期的那样，在植物的卷须、雄花、子房中检测到GFP荧光。

总的来说，从1132颗种子中产生了三个独立的转基因系。

同样的方法应用到另一个葫芦科植物，甜瓜，6苯甲酸嘌呤的浓度降低到0.5毫克/升。1400颗种子获得了三个阳性GFP转基因甜瓜。

crispr cas9基因编辑黄瓜

参考文献

Engineering Non-transgenic Gynoecious Cucumber Using an Improved Transformation Protocol and Optimized CRISPR/Cas9 System

Bowen Hu, Dawei Li, Xin Liu, Jingjing Qi, Dongli Gao, Shuqiao Zhao, Sanwen Huang, Jinjing Sun， Li Yang