利用CRISPR Cas14a蛋白高度特异性检测临床样本中的BRAF V600E 突变

作者：Magigen

BRAF V600E突变是一种单核苷酸变异SNV，广泛存在于各种癌症中，研究证明它与某些疾病的预后和发展密切相关。

重庆医科大学的研究人员利用CRISPR Cas14a蛋白和滚环扩增技术(RCA)，开发了一种新的检测方法，以满足检测穿刺样本中高度特异性BRAF V600E突变的巨大需求。

在这项研究中，研究人员设计了一个锁式探针(Padlock probe)来识别和触发随后的连接酶链反应 (LCR)。

由于Taq DNA连接酶的作用，在 BRAF V600E 突变存在的情况下产生了大量连接的环形锁式探针，随后通过 RCA 产生长而重复的单链 DNA。

获得的扩增子触发了CRISPR Cas14a蛋白反式切割。CRISPR/Cas14a在识别单碱基突变的ssDNA方面表现出色，显着提高了突变鉴别的特异性。在**条件下，该检测方法可以识别低至 0.307 fM的BRAF V600E 突变，线性范围从 1 fM 到 10 pM。另一方面，双重识别策略使该方法对SNV的检测具有极好的特异性。此外，该方法已成功用于鉴定临床细针穿刺样本中的 BRAF V600E 突变，证明了超特异性鉴定低丰度 BRAF V600E 突变的巨大潜力，并为癌症的诊断和治疗提供了一种新方法。

BRAF V600E突变的LCR-Cas14a蛋白检测策略示意图

图1. BRAF V600E突变的LCR-Cas14a蛋白检测策略示意图。

BRAF基因是一种激酶编码基因，主要调节影响细胞生长、增殖和凋亡的MAP/ERK信号通路。

BRAF 基因第1799位的单核苷酸突变导致残基600 (V600E) 处的缬氨酸到谷氨酸取代，从而导致 RAF 蛋白的组成型激活。已在多种癌症中发现 BRAF V600E 的突变，包括甲状腺乳头状癌 (PTC)、非霍奇金淋巴瘤、结直肠癌、黑色素瘤和非小细胞肺癌。一些研究表明，BRAF V6000E 是 PTC 中最常见和特异性的基因突变，并且在 PTC 复发和 PTC 相关死亡率之间表现出强烈的关联。

细针穿刺 (FNA) 是诊断甲状腺结节的通用方法。然而，由于非诊断性、不确定和假阴性结果，细胞学评估并不总是准确的。与单纯细胞学检查相比，细针穿刺活检（FNB）分析BRAF V600E可提高PTC的诊断准确性。

因此，BRAF V600E突变的精确和超灵敏检测将为有价值的诊断信息和个性化治疗提供有力的证据，这对预测预后有很大的好处。目前，已应用多种方法来鉴定 BRAF V600E 突变，包括高分辨率熔解 (HRM) 分析、二代测序、Sanger 测序、数字PCR 和免疫组织化学。BRAF V600E突变分子诊断的金标准方法是直接Sanger测序，特异性可靠。然而，据报道，桑格测序的敏感性仅能识别 7%至20% 的突变等位基因。

此外，数字PCR 和下一代测序提高了检测临床样本中低丰度突变 DNA 的灵敏度，但对专业人员的要求和高成本的实验室环境限制了它们的广泛应用。因此，仍然需要用于识别BRAF V600E突变的简单、高度特异性和超灵敏的方法。

连接酶链式反应 (LCR) 已被用于检测单核苷酸变异 (SNV)，因为它在识别单碱基错配方面具有出色的特异性。在 LCR 过程中，只有当锁式探针通过氢键与目标 DNA 完全互补时，才会发生酶促连接。因此，LCR 能够识别 SNV。然而，基于 LCR 的方法大多使用合成 DNA 作为靶点，这无法满足对检测高丰度正常基因组 DNA 中突变拷贝水平低的真实临床样本日益增长的需求。来自原核生物的 CRISPR Cas系统称为规则聚类间隔的短回文重复序列，广泛应用于核酸分析。CRISPR-Cas系统可以通过 20nt crRNA 识别目标核酸，这确保了精确的核酸靶向和最小的脱靶结合。crRNA 可针对任何感兴趣的 DNA 或 RNA 进行编程，以与靶核酸杂交，以激活其多周转反式切割活性，切割附近的 ssDNA 报告基因，从而实现灵敏和特异性的核酸检测。CRISPR Cas14a蛋白一种新型 2类 CRISPR 效应子，其大小约为先前已知的 2 类 CRISPR RNA 引导酶的一半。此外，与CRISPR Cas12a 和 Cas13a 等其他 CRISPR/Cas 蛋白相比，Cas14a 在核酸分析方面具有多项优势，可以不依赖 PAM 的方式识别单链 DNA (ssDNA) 靶标，并附带切割随机 ssDNA 以进行信号放大。更重要的是，当突变位点出现在 ssDNA 中间时，CRISPR Cas14a 在识别 SNV 方面表现出很强的活性。因此，Cas14a 的这些出色功能使其成为高保真临床 SNV 检测的潜在工具。

重庆医科大学的研究人员利用美格生物Magigen CRISPR Cas14a蛋白与LCR技术结合，用于高特异性检测临床样本中的 BRAF V600E 突变。锁式探针高保真连接后，RCA生成长而重复的单链DNA，随后通过其与扩增子的特异性杂交，对SNV的Cas14a蛋白进行双重识别。LCR 和 Cas14a 的双重识别确保了该策略的高度特异性。另一方面，RCA的高效扩增和Cas14a的侧枝切割活性的耦合提供了一个强大的信号增强，能够高度灵敏地检测低丰度BRAF V600E突变。研究人员成功地将该方法应用于细针穿刺样本中BRAF V600E突变的鉴定，表明该策略是一种有希望的精确分子诊断工具。

文件来源

A dual identification strategy based on padlock ligation and CRISPR/Cas14a for highly specific detection of BRAF V600E mutation in clinical samples