CRISPR诊断技术正带来一场变革

在CRISPR技术推出的早期，主要是用于基因编辑。但是随着SHERLOCK、DETECTR快速检测技术的推出，CRISPR技术开始在快速检测领域崭露头角。随着这些技术的不断升级、完善，检测水平、检测灵敏度已经逼近传统的PCR检测技术，一场检测技术的革命即将到来。今天，美格君就和大家一起看看，CRISPR是如何改变医学诊断的。

以往，CRISPR给人们的印象了是一种基因编辑技术。但是，它已经用于诊断多种疾病。大家都知道crispr cas蛋白，也叫cas酶。Crispr cas9蛋白常用于基因编辑技术。而目前，crirsprcas9蛋白、cas12蛋白、cas13蛋白、cas14蛋白已经被人们利用，成功开发出全新的CRISPR快速检测技术，可以诊断传染性疾病，如寨卡病毒，以及涉及核酸的非传染性疾病，如癌症。

让我们看看几种常见的CRISPR Cas蛋白酶在疾病诊断方面的实际应用。

一、CRISPR-Cas9蛋白诊断检测方法

CRISPR Cas9蛋白已经应用于疾病诊断。被用于诊断的cas9蛋白有两种，有酶活性的Cas9蛋白，无核酸酶活性的dead Cas9蛋白（dCas9蛋白）。

1. 活性cas9蛋白

   将具有催化活性的Cas9用于疾病诊断的方法分为两类：样品制备和检测

   在样品制备中使用Cas9蛋白

   Cas9蛋白被用于一种被称为FLASH（通过杂交发现低丰度序列）的诊断方法的制备步骤。“杂交”是指Cas9核糖核蛋白中的crisprRNA（crRNA）与靶DNA“杂交”。在FLASH中，cas9蛋白的目标不是一个位点，而是利用大量的配套crRNA, 对应上百个位点。

   这些crRNA被设计成靶向Cas9，将病原体的基因组DNA分解成大小合适的片段，用于下一代测序（NGS）。然后进行扩增子测序，这样就可以检测大量的基因序列，例如抗生素抗性基因。

   在诊断检测中使用Cas9的方法。

   NASBA-CRISPR裂解（NASBACC）方法是在检测中使用活性Cas9蛋白系统的一个案例。这种方法方便携带、成本低。它可以区分美洲和非洲寨卡病毒株，它们的基因组在原间隔基序PAM位点上只有1个碱基的差异。这种方法涉及到RNA的逆转录和RDA恒温扩增技术，这一过程被称为基于核酸序列的扩增（NASBA），产生足够的双链DNA，dsDNA, 被Cas9蛋白切割。根据DNA序列的不同，如果存在要找的PAM位点，dsDNA被切割; 如果PAM位点不同，有改变，dsDNA将不被切割。在NASBA扩增反应过程中，不仅DNA扩增，还表达了一个报告基因LacZ。这可以让检测试纸条改变颜色。然而，如果目标序列存在并因此被扩增，Cas9蛋白会切割DNA，并且没有颜色变化。基于crispr cas9蛋白的方法具有高度的通用性，可以使用不同的gRNA序列，将Cas9蛋白定向到任何具有相邻PAM的指定目标位点。人们还利用cas9蛋白开发了检测其他的疾病的方法，例如检测诊断人乳头状瘤病毒。

2. 失活的dcas9蛋白

   PC, paireddCas9，成对dCas9报告系统是使用dCas9的系统的一个范例。这项技术由2个dCas9分子组成，每个分子与荧光素酶的半分子相连。当两个dCas9分子被向导RNA（gRNA）引导到相关的病原体基因组中彼此相邻的预先指定的DNA序列时，荧光素酶的两半结合在一起，并发出光。PC-reporter系统非常敏感，可以检测到少至1个DNA分子，并被证明，可以检测结核病等疾病病原体，只要在适当的距离处有2个良好的靶序列，就可以检测到任何病原体DNA序列。

   另一种基于dCas9的诊断系统具有更简单的方法，可用于未纯化的细菌全细胞裂解物。与许多基于CRISPR-Cas9的方法一样，不需要PCR或其他扩增步骤。该方法将His标记的dCas9靶向致病DNA中的特定位点，然后使用nickel-bead pull-down镍珠沉降法将dCas9固定到DNA上。如果检测呈阳性，整个基因组DNA被pull down沉降，而不是剪切或切割。在镍珠步骤之后，将SYBR Green试剂直接添加到沉降的样品中。当SYBR-Green与dsDNA结合时，它会发出强烈的荧光，从而检测dsDNA是否被沉降。

   如果看到正的SYBR Green信号，则已知目标位置存在于样本中。当该方法用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌methicillin-resistant S.aureus 时，其荧光信号比对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌methicillin-sensitive S.aureus高10倍以上，显示出高度的特异性。这种约30分钟的快速检测的技术有可用于检测几乎所有的DNA序列。检测限为31ng/mL或10个菌落形成单位（CFU）/mL。只要gRNA序列对相关的病原体具有特异性，这是一种高度特异性的检测方法。

二、Cas12、Cas13和Cas14诊断方法

Cas12酶、Cas13酶和Cas14酶有很多不同的亚型，包括Cas12a蛋白，Cas12b蛋白，Cas13a蛋白，Cas13b蛋白，Cas13d蛋白和Cas14a蛋白。这些crisprcas蛋白酶已经被用于多种快速诊断技术。既可以用单个cas蛋白检测一种病原体，也可以同时使用了几种酶，进行多重分析，以区分多种病原体。

Crisprcas蛋白的附带切割功能

基于Cas12蛋白、Cas13蛋白和Cas14蛋白的诊断技术依赖于一种称为附带切割的过程。当某种酶按照gRNA的指示与靶标结合时，该酶不仅能切割靶标，还能切割目标附近的其他核酸。事实上，在附属切割过程中，Cas12酶和Cas14酶切割附近的ssDNA分子，Cas13酶切割附近的RNA分子。因为一个核酸的许多分子在一个反应中被裂解，这些酶的作用很适合信号放大方案。

SHERLOCK（SpecificHigh-sensitive enzymetic Reporter unLOCKing）技术已用于检测RNA序列，DETECTR（DNA内切酶靶向CRISPRtrans Reporter）技术已用于DNA检测。SHERLOCK和DETECTR都需要在CRISPR裂解步骤之前对目标序列进行恒温温扩增，以获得足够数量的相关序列用于检测。在SHERLOCK中，RDA等温扩增步骤之后是T7转录以产生RNA。在DETECTR中，因为是靶向DNA，而不是RNA，不用执行T7转录。标准的DETECTR使用LbCas12a，它需要一个PAM位点，而SHERLOCK使用一个或多个Cas13蛋白酶和其他酶，去掉了对PAM位点的要求。DETECTR还有一个改进版，它使用Cas14a，这也去掉了对PAM站点的要求。

DETECTR和SHERLOCK检测系统都使用核酸探针。DETECTR用DNA探针，SHERLOCK用RNA探针。探针的一端可能有生物素，另一端有FAM荧光团。核酸探针被Cas蛋白酶切割，让两端分离。对于用FAM萤光团和生物素标记的探针，结果可以在横向流动条上显示，其中正信号显示2条带；负信号只有1条带。其他探针-检测器系统，可以以其他方式读取结果，例如，通过使用荧光板读取器。

DETECTR已被证明能区分两种形式的人乳头瘤病毒HPV。

SHERLOCK已被证明能检测寨卡病毒和登革热病毒，并能检测非小细胞肺癌患者液体活检中的不同突变。

对于大规模的多重病毒检测，已经开发出用于核酸多重评价的组合阵列反应（CARMEN）系统，并显示出很大的前景。使用基于Cas13蛋白的方法进行检测，CARMEN允许1个阵列测试4500多个CRISPR目标。

CRISPR在疾病诊断中的应用前景