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表观遗传编辑器CRISPRoff有哪些优势?是如何工作的?

作者:基因编辑

基因编辑技术

表观遗传编辑器

CRISPR基因编辑 vs 表观遗传编辑

CRISPR基因编辑技术因为能够高效地在基因组特定位点插入或移除基因,或修复致病基因突变,成为许多遗传疾病治疗的最新选择。CRISPR技术在基因编辑的过程中会将DNA双链切开,然后对其进行修复,在这个过程中可能导致出现未知突变、脱靶效应和基因表达不可控等副作用。因此,科研人员开始寻求在使用CRISPR过程中不打开DNA双链的方法。

其中一种方法叫表观基因组编辑,英文是epigenome editing。表观基因组编辑方法不直接编辑基因,而是调节基因表达的“开关”,达到最终的治疗目的。

在病毒感染和癌症中,表观基因组发挥着核心作用。表观遗传通过DNA甲基化影响基因表达,当甲基基团标签被贴在DNA上时,可导致基因沉默,而且表观基因组与基因组一样具有可遗传性。

具体来说,表观遗传基因沉默可以通过甲基化(将特定化学修饰添加到DNA链中的特定位点)来实现,修饰后的DNA模版无法与RNA聚合酶结合,从而DNA模版无法转录为mRNA,最终靶标蛋白表达被抑制。


基因工程2.0

2021年4月,美国加州大学旧金山分校和麻省理工学院的研究人员开发了一种新型表观遗传基因组编辑工具 "CRISPRoff ",这一工具能在不改变遗传密码的情况下沉默人类细胞中几乎所有的基因。这种沉默会在细胞的后代中保持数百代,且具有可逆性,在使用另一种“CRISPRon”工具后可以重新激活被沉默的基因。该项目的部分资金来自美国国防高级研究计划局2017年的一笔拨款,用于创建一个可逆的基因编辑器。

CRISPRoff编辑器是如何工作的?

CRISPR系统之所以能成为有效的基因编辑工具,要归功于其中两个重要的功能组件:

一个是行DNA剪切功能的DNA内切酶。

另一个是归巢装置,能发挥特异性寻靶功能,可以精确控制编辑位置。

表观遗传编辑器CRISPRoff的原理

为了构建作用于表观基因组的CRISPRoff,研究人员保留了CRISPR的归巢装置,去除了DNA切割酶功能,然后再为其增添一种能作用于表观基因组的酶。

CRISPRoff有哪些优势?

最新构建出的表观遗传编辑器有两种类型:CRISPRoff-V1和CRISPRoff-V2。

结果显示,CRISPRoff-V2可在多种细胞系中持久抑制内源基因的表达,并能实现多个基因的组合表达调控,而且CRISPRoff对表观遗传修饰和基因转录的调控具有很高的特异性。

在两种CRISPRoff工具中,CRISPRoff-V2的沉默作用更强大。


CRISPRoff的设计及优化2.jpg

图1. CRISPRoff的设计及优化                             美格生物摘自Cell


该工具能够通过促进靶位点附近的DNA甲基化,实现长久且可遗传的基因作用。在以CLTA基因为靶点的单细胞克隆实验中,研究人员观测了表观遗传记忆的持久性,并检测了CLTA在单细胞克隆中的表达。结果表明,这一基因在被处理的细胞中保持沉默,基因抑制效果至少持续了15个月,延伸到450次细胞周期,38个克隆(共39个)中的CLTA基因均依然能保持沉默。同时,多个测序分析表明,CRISPRoff还具有高度的特异性。


CRISPROFF-2.jpg

图2. CRISPRoff对CLTA的抑制效果持续了至少15个月       美格生物摘自Cell


CRISPRoff / CRISPRon可逆开关

表观遗传组编辑的优势之一在于该工具具有可逆性,被关闭的基因能够重新被打开。先前的研究表明,TET(ten-eleven translocation)家族酶在DNA去甲基化过程中扮演着重要的作用。

除了持久性方面的优异特性,CRISPRoff还具有可逆性,使用另一种CRISPRon工具可以去除CRISPRoff编入的甲基化标记,重新激活被沉默的基因,实现使这一过程的完全可逆化。

为了评估CRISPRoff介导的基因沉默的可逆性,在这项试验中,研究人员将TET1与dCas9融合,并对融合蛋白进行优化,设计出了可去除甲基化标记的CRISPRon系统。在经CRISPRoff转染后CLTA受到抑制的细胞中,CRISPRon的使用能够在2天内重新激活CLTA表达,逆转DNA甲基化修饰和转录抑制。



CRISPRon逆转基因沉默.jpg

图3. CRISPRon逆转基因沉默(美格生物译自Cell)


DNA的碱基有腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)四种。传统观点认为,甲基化只能使基因组中CG序列高度集中的位点CpG岛(CGI)沉默,而近三分之一的人类基因缺乏CpG岛,理论上CRISPRoff对这类基因无效。


然而,但CRISPRoff的表现令研究人员惊讶的是,CRISPRoff表观遗传编辑并不局限于具有典型CpG岛的基因,也能够沉默没有CpG岛结构的基因。在试验过程中他们发现了300多个缺乏CGI的基因在经过CRISPRoff处理后基因转录受到抑制,并且后续的研究验证了CRISPRoff能够针对人类基因组中大多数基因进行表观遗传编辑,而这种对基因转录的持久抑制可能依赖于sgRNA靶位点附近组蛋白H3K9me3修饰和DNA甲基化修饰的形成。

表观遗传编辑器CRISPRoff在基因治疗治疗和研究中的应用

为了研究CRISPRoff应用于实际治疗的可行性,研究人员在诱导多能干细胞中测试了该方法。研究人员在诱导多能干细胞中探究了CRISPRoff的治疗潜力。

研究人员发现,CRISPRoff在诱导多能干细胞(iPSCs)、人骨肉瘤细胞(U2OS)、海拉细胞(HeLa)以及慢性粒细胞白血病癌细胞(K562)等多种细胞中起作用。

研究人员通过特异性地沉默干细胞中的特定基因,成功诱导干细胞分化为神经元细胞。此外,CRISPRoff靶标的基因在90%的干细胞衍生神经元细胞中仍然保持沉默,这说明即使改变细胞类型,细胞内仍会保留对CRISPRoff系统进行的表观遗传学修饰的记忆。

CRISPRoff如何应用于基因治疗?

基因治疗案例:

编码Tau蛋白的基因,该基因与阿尔茨海默病有关

研究人员证明使用CRISPRoff可以用来降低Tau的表达,尽管不是完全关闭。结果显示,这是一种使Tau沉默并阻止该蛋白表达的可行策略。但随之而来的问题是,如何将其传递给成年人?它真的足以影响阿尔茨海默氏症吗?这些都是悬而未决的大问题,尤其是后者。

即使CRISPRoff不能治疗阿尔茨海默氏症,它也有可能应用于许多其他疾病。尽管向特定组织的递送对CRISPRroff等基因编辑技术来说仍然是一个挑战,研究人员已经证明,可以将其以DNA或RNA的形式瞬时递送,这与Moderna和BioNTech冠状病毒疫苗的基础技术相同。

诱导干细胞分化为神经元细胞

图4. 通过特异性地沉默干细胞中的特定基因,成功诱导干细胞分化为神经元细胞     (图片来源 Cell)


这表明CRISPRoff仅需一次给药即可实现持久的治疗,体现了CRISPRoff巨大的治疗潜力。

这种可编程的表观基因组编辑是可调、可逆的,无需切割DNA,从而有效地避免了与基因编辑相关的细胞毒性。但研究人员也指出,全部的治疗潜力仍需进一步的工作来实现。


CRISPRoff系统将有助于科研人员广泛地探索表观遗传抑制的生物学规律,并为控制基因表达、靶向增强子和探索表观遗传的原理提供了强有力的工具。当然,仍然需要更多的研究以挖掘CRISPRoff的治疗潜力。美格君认为利用CRISPRoff,研究人员可以让基因组中的任何一部分沉默,这一工具可以为探索基因组功能发挥重要作用。

CRISPR-Cas9编辑器 VS CRISPRoff表观遗传编辑器

经典的CRISPR-Cas9系统使用在细菌免疫系统中发现的一种名为CRISPR/Cas9的DNA切割蛋白。该系统可以使用单一的引导RNA靶向人类细胞中的特定基因,其中Cas9蛋白在DNA链中产生微小的断裂。然后,细胞固有的修复机制将这些"缺口补上"。

以CRISPR/Cas9系统为代表的基因组编辑工具需要改变DNA序列,往往面临着脱靶导致的安全性问题。

因为这些方法改变了潜在的DNA序列,所以它们是**性的。此外,对细胞修复机制的结果难以控制。


CRISPRoff表观遗传编辑器是一种不会改变DNA序列本身,而是改变细胞中读取DNA序列的方式的编辑器。

表观遗传基因沉默通常是通过甲基化来实现的,甲基化是在DNA链的某些位置添加化学标签,这会导致DNA无法被RNA聚合酶访问,RNA聚合酶将DNA序列中的遗传信息读取到信使RNA转录物中,信使核糖核酸转录物最终可能成为蛋白质的蓝图。


利用CRISPRoff技术,人们可以编写一个程序快捷地表达一种蛋白质,该程序会被细胞记住和无限期地执行。它改变了游戏规则,利用CRISPRoff,你只需要修改一下程序,就可以通过细胞分裂来传递这些改变。


所以,在某种程度上来说,CRISPRoff技术可以看成CRISPR-Cas9编辑器 的V2.0升级版。

此外,CRISPRoff还可以帮助研究人员了解表观遗传学修饰通过细胞分裂传递的机制,这是生物医学中的一个巨大问题。


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CRISPR Cas14aC015S100pmol/盒1280
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