CRISPR技术与无PAM核酸酶的研究

CRISPR技术给生物技术领域带来了巨大的变化。

这些技术依赖于CRISPR Cas核酸酶，以及对应的向导RNA（gRNA）。

gRNA的引导部分帮助核酸酶找到互补的核酸序列，核酸酶酶切这些序列。

这种可编程和定制序列的能力改进了现有的方法，促进了新方法的出现。

CRISPR被用于越来越多的体外诊断IVD。

要使得CRISPR技术更容易的使用，需要克服一些制约因素。一个制约因素是特定Cas核酸酶的靶向序列。

成功的靶向需要两个因素：gRNA和核酸靶点之间的广泛互补性，以及靶点侧翼的短序列PAM（图1a）。

图1a

虽然有些因素会影响哪些序列可以被选为靶点，但总可以有办法找到靶点。

然而对PAM约束的灵活性要小得多。

在探测导向靶互补性之前，核酸酶扫描可用DNA，以寻找PAM（图1a）。因此，核酸酶会忽略一个与向导完全互补、但缺乏PAM的序列。

因此，PAM是CRISPR–Cas瞄准目标关键。

图1b:CRISPR-Cas系统中PAM在目标识别和自我/非自我识别中的应用。

A. 两个检查点，PAM和一个与之匹配向导的侧翼靶点，用于Cas核酸酶的成功识别。Cas9和单导向RNA（sgRNA）是一个典型的例子。

匹配的PAM和靶标导致R环形成和靶标裂解，而非PAM或非匹配的靶标阻断都是由Cas核酸酶进行识别的。

B. PAM在原核免疫防御中自我识别和非自我识别中的作用。Self是指在宿主基因组或内源性质粒上的编码CRISPR阵列中的间隔区，而nonself是指诸如噬菌体或外源性质粒之类的入侵核酸。

sgRNA经过设计，成一种易于使用的融合体，促使处理过的tracrRNA和天然CRISPR RNA 分子之间融合。

PAM允许这些原核免疫系统区分外来遗传物质（非自身）中的DNA靶点与由在自身CRISPR阵列中编码、产生向导RNA、相同DNA序列（图1b）。

如果没有PAM约束，CRISPR-Cas系统将以CRISPR阵列为目标，导致潜在的灾难性自身免疫反应。

几乎所有CRISPR核酸酶都需要某种形式的PAM。

然而，已知的PAM序列并非所有Cas核酸酶都共享，而是有很大的差异，具有不同的序列、长度、复杂性、方向以及与靶的距离。

这一约束限制了我们用CRISPR瞄准任意序列的能力，我们希望可以放松这些约束。

我们设计出一些特性良好的核酸酶，可以减少PAM的约束。我们探讨了开发真正的无PAM约束的核酸酶，并提出了一种基于组装PAM依赖性核酸酶的竞争方法，这些核酸酶一起识别所有可能的序列。

PAM的起源与机制

作为目标识别的一部分，Cas核酸酶通过两个检查点。首先，核酸酶评估目标侧翼的序列（图1a）。对于DNA靶向核酸酶，这个序列通常是一个或多个序列，统称为PAM。

相反，RNA靶向核酸酶（例如VI型Cas13）可评估侧翼序列与gRNA内编码的序列之间的互补性。

作为第二个检查点，核酸酶通过R-环形成来评估导向物和DNA靶链之间的碱基配对（图1a）。如果两个检查点都通过了，那么核酸酶通过其特定的作用机制切割靶点。因此，PAM是防止核酸酶进入某些DNA序列的重要把关者，即使它们与向导完全互补。

我们已经用一些Cas核酸酶进行PAM识别，例如SpyCas9。另外，Cas12a核酸酶依赖于三个不同的结构域（PI、REC1和WED）来识别PAM。

识别不仅通过检测特定碱基，而且通过检测双链DNA的形状和主动拒绝非PAM序列来实现。

随着技术的进步和扩展，对Cas核酸酶的灵活靶向性的需求与日俱增。科学家一直在努力，扩展PAM， 以适应CRISPR技术发展的需要。

研究方向主要有两个：

1. 从自然界中挖掘新的Cas酶同源序列。

2. 通过蛋白质工程，利用具有良好特性的核酸酶改变PAM识别。  

除了对少数Cas9酶进行更深入的表征外，人们的努力转向探索自然界中发现的Cas9核酸酶的全部多样性。

迄今为止，在已测序的基因组和后基因组中已鉴定出900多种不同的Cas9同源物，更多同源物可能有待进一步测序工作的发现。

探索这一扩展集已经产生了各种各样的Cas9酶，具有不同的PAM图谱、蛋白质大小和**活性温度。

在这个庞大的集合中，一种优先排序的方法是筛选系统发育不同的Cas9同源序列，以确定具有独特PAM偏好的同源序列。

最值得注意的是，研究发现ScCas9在PID之外与SpyCas9有广泛的同源性，但是它可以识别NNG PAM，在第二个位置略微倾向于A碱基。

这是目前自然界中发现的最宽松的PAM约束情况。大自然界拥有大量与CRISPR相关的单效应子核酸酶，可以应用于CRISPR技术。

例如，来自V-A型CRISPR的Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas12f、Cas12j、Cas12k等。

已知的Cas酶的多样性使得PAM识别更为灵活，需要很少的突变就可以改变。

用蛋白工程改变PAM识别

与同源物挖掘相对照的是，蛋白工程是从单个CRISPR核酸酶开始改变和拓宽PAM识别的有力手段。

然而，蛋白工程带来了多重挑战。每个残基都可以被其他19个氨基酸之一取代，从而产生了天文数量的组合来筛选大部分蛋白。

我们特别关注改变PAM识别。改变PAM识别的最初努力始于SpyCas9。

之后的研究以NGG为起点， 旨在以较不严格的模体拓宽PAM识别。

Nishimashu等人应用结构引导设计和突变体筛选，开发了SpCas9-NG。

图3:SpyCas9的PAM工程化变体中的突变。

除了减少SpyCas9的PAM偏好或放松共同模体之外，最近的研究进展是设计SpyCas9的非自然PAM偏好。

Miller等人生成了三种SpyCas9变体，分别称为SpCas9 NRRH，SpCas9 NRTH和SpCas9 NCRH，引导PAM偏好NRRH，NRTH和NRCH模体（H=A，C，T）。

PAM工程正在从Cas9扩展到其他具有独特性质的CRISPR核酸酶。

例如，Liu R. M.等人最近的一项研究，将Cas12a同源MAD7中涉及PAM识别的两个结构域（WED-1和REC1）替换为来自TsCas12a的域，产生了**个嵌合Cas12a。

嵌合体表现出更严格的PAM识别，证明了工程创建的Cas12a嵌合体可以改变PAM。

无PAM核酸酶

无PAM核酸酶的主要优点是显而易见的：理论上能够靶向任何序列（图4）。

这种灵活性将大大简化具有高着靶、低脱靶活性的位点的选择，产生可预测的破坏性插入或缺失，或将碱基编辑窗口直接置于靶核苷酸上方。

但是，有一些严重的缺点值得考虑（图4c）。

对于从DNA构建体表达的gRNA，这种DNA的自我靶向将是直接的，不可避免的，并且可能是灾难性的，突显了CRISPR-Cas系统进化出PAM的全部原因。

图4:PAM工程的示意。

a. 有PAM核酸酶   

b. 无PAM核酸酶对比可以识别每个可能序列的核酸酶库, 该库由4个核酸酶组成，可以识别第二个位置的一个碱基。

c. 无PAM核酸酶，PAM宽松核酸酶，PAM严格核酸酶和核酸酶库的定性比较。

作为一个独特的缺点，没有PAM的核酸酶将搜索基因组中的每个序列。这会带来两个问题：延长核酸酶找到目标的时间和增加脱靶倾向（图4b）。

幸运的是，添加降低错配耐受性的突变可以抵消这种影响，甚至可以提高着靶编辑的频率，例如生成高保真版本的SpRY，Sc++和enAsCas12a。

我们认为不含PAM的核酸酶可能并不普遍适用于每种CRISPR技术。

鉴于无PAM核酸酶的潜在缺点，该领域研究应该如何进行？

首先，工程SpyCas9核酸酶几乎不含PAM，其他类型的Cas9，Cas12a和其余Cas核酸酶在接近无PAM状态之前有足够的空间放松PAM识别。

为了加速这些核酸酶的开发，同源挖掘和PAM工程的结合提供了一个富有成效的途径，例如创建Sc++。

在同源物挖掘中，特征化的Cas9核酸酶表明，自然界中存在特殊的PAM多样性，仍有待完全发掘。

未来的工作可以深入研究已建立、但特征不佳的CRISPR-Cas类型，例如I型和V型系统，这些类型最近已被重新用于不同的CRISPR技术。

作为最后一点，我们提出了除了无PAM核酸酶之外该领域可以追求的替代方案：核酸酶库（图4b）。

无论PAM是单个碱基（例如NG）还是一系列碱基（例如NAAA），每种核酸酶都保留对定义的PAM的识别。

可以针对性组装这些核酸酶库，以覆盖所有可能的序列，从而实现集体PAM无关状态。

然后，研究人员将根据所需目标从该库中进行选择，使用侧翼序列确定应使用哪种核酸酶。

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参考文献

CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease

Daphne Collias & Chase L. Beisel