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如何进行细胞电穿孔?电穿孔方案实例作者:基因编辑 如何进行电穿孔本方案改编自Alberto Martin实验室的研究生Alex Ling的工作方案。他使用CRISPR技术处理CH12F3-2细胞。 进行电穿孔需要的材料材料
如何进行电穿孔? 电穿孔的步骤准备电穿孔用的细胞1. 在电穿孔当天,确保CH12F3-2细胞处于对数生长期。通常情况下,前一天接种1百万个细胞于10毫升CH12F3-2细胞培养基中即可。每个电穿孔需要1百万个细胞。电穿孔2. 将1百万个CH12F3-2细胞悬浮于600微升ZAP缓冲液中,然后与5微克CRISPR构建体混合,在4毫米电穿孔杯中组合。3. 在BioRad GenePulser Xcell电穿孔仪中进行电穿孔,条件如下(表1):
表1 电穿孔仪器的参数设置 magigen.com 4. 立即把电穿孔后的细胞置于冰上,孵育5分钟,然后将其铺板于10毫升CH12F3-2细胞培养基中,并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。 关键步骤立即把电穿孔后的细胞置于冰上,孵育5分钟,然后将其铺板于10毫升CH12F3-2细胞培养基中,并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。 5. 将2×10^6个细胞悬浮于100微升电穿孔溶液中,并加入2毫米电穿孔杯。 6. 加入5微克CRISPR/Cas9和gRNA质粒。 7. 以250伏特电压电穿孔5毫秒。 8. 立即将电穿孔后的细胞转移至1毫升细胞培养基中。 关键步骤尽量缩短电穿孔与转移细胞之间的时间,以提高细胞活力。 电穿孔后72小时9. 将电穿孔后的细胞连续稀释至10-20个细胞/毫升,并使用多通道移液枪将100微升细胞悬液分配至96孔平底板。通常情况下,每孔20个细胞、总共10块96孔板可以获得大约100个克隆,非常适合96孔PCR板的使用。也可以使用单细胞分选法,但这较为昂贵!需要使用血球计数器进行准确而精确的计数;例如,一个视野中计数12个细胞并不准确。每次稀释不要超过1:100的比例。理论上,每孔0.2个细胞(20个细胞/毫升),总共10块96孔板应该可以获得192个克隆,但由于细胞吸附塑料而造成的损失,实际上获得的克隆数目会少于理论值;不过,您通常可以稳定地获得大约100个克隆。您可以筛选较少的克隆,但开始时至少筛选96个克隆是可行的,经过练习后,同时筛选两个构建体(2×96个克隆)也是可行的。 需要注意的是,电穿孔后72小时的休息期可能不是所有基因的**选择,特别是那些缺失会导致生长缺陷的基因。 10. 将克隆铺板后的细胞放置于长期37摄氏度的培养箱中,以减少水分蒸发,培养7至10天。克隆在第4-5天时可以通过显微镜观察到,在第5-7天时肉眼可见。从第24步开始,时间安排有一定的灵活性。 相关阅读
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