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什么是PCR假阴性和假阳性?pcr假阴性和假阳性的原因作者:PCR技术 PCR技术什么是PCR假阴性?PCR假阴性, 英文是PCR false-negative, 是指不出现特异扩增带。 为什么会产生PCR假阴性?PCR假阴性的原因可能有: 引物设计不合理,酶失活或酶量不足,模板量太少,退火温度不合适,循环次数过少,产物未及时电泳检测等。 PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备, ②引物的质量与特异性, ③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板: ①模板中含有杂蛋白质, ②模板中含有 Taq酶抑制剂, ③模板中蛋白质没有消化除净, 特别是染色体中的组蛋白, ④在提取制备模板时丢失过多, 或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时, 不出现扩增带, 极有可能是标本的消化处理, 模板核酸提取过程出了毛病, 因而要配制有效而稳定的消化处理液, 其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活: 需更换新酶, 或新旧两种酶同时使用, 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。 引物: 引物质量、 引物的浓度、 两条引物的浓度是否对称, 是 PCR 失败或扩增条带不理想、 容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题, 两条引物一条浓度高, 一条浓度低, 造成低效率的不对称扩增, 对策为: ①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看 OD值, 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳, 一定要有引物条带出现, 而且两引物带的亮度应大体一致, 如一条引物有条带, 一条引物无条带, 此时做 PCR 有可能失败, 应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高, 一条亮度低, 在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存, 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分, 导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理, 如引物长度不够, 引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度: Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大, 浓度过高可降低 PCR扩增的特异性, 浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变: 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、 30ul、 50ul。 或 100ul, 应用多大体积进行 PCR 扩增, 是根据科研和临床检测不同目的而设定, 在做小体积如 20ul后, 再做大体积时, 一定要模索条件, 否则容易失败。 物理原因: 变性对 PCR 扩增来说相当重要, 如变性温度低, 变性时间短, 极有可能出现假阴性; 退火温度过低, 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物 与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 有时还有必要用标准的温度计, 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度, 这也是 PCR 失败的原因之一。 靶序列变异: 如靶序列发生突变或缺失, 影响引物与模板特异性结合, 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列, 其 PCR 扩增是不会成功的。 什么是PCR假阳性?PCR假阳性, 英文PCR false-positive, 是指在没有目标DNA或RNA的情况下,PCR检测结果错误地显示为阳性。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致, 有时其条带更整齐, 亮度更高。 为什么会产生PCR假阳性?PCR假阴性的原因可能由多种因素导致,美格君认为主要包括实验污染、试剂污染、PCR扩增的非特异性反应或仪器的误读。 PCR假阳性的常见原因: 引物设计不合适: 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性, 因而在进行 PCR 扩增时, 扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。 靶序列太短或引物太短, 容易出现假阳性。 需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染: 这种污染有两种原因: 一是整个基因组或大片段的交叉污染, 导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决: ①操作时应小心轻柔, 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ②除酶及不能耐高温的物质外, 所有试剂或器材均应高压消毒。 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ③必要时, 在加标本前, 反应管和试剂用紫外线照射, 以破坏存在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染, 这些小片段比靶序列短, 但有一定的同源性。 可互相拼接, 与引物互补后, 可扩增出 PCR 产物, 而导致假阳性的产生, 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。 美格生物部分热销逆转录酶价格
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