什么是PCR假阴性和假阳性？pcr假阴性和假阳性的原因

作者：PCR技术

PCR技术

PCR假阴性, 英文是PCR false-negative, 是指不出现特异扩增带。

PCR假阴性的原因可能有：

引物设计不合理，酶失活或酶量不足，模板量太少，退火温度不合适，循环次数过少，产物未及时电泳检测等。

PCR反应的关键环节有

①模板核酸的制备，

②引物的质量与特异性，

③酶的质量及活性

④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

①模板中含有杂蛋白质，

②模板中含有 Taq酶抑制剂，

③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，

④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看 OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg²⁺浓度： Mg²⁺离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大，浓度过高可降低 PCR扩增的特异性，浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、 30ul、 50ul。或 100ul，应用多大体积进行 PCR 扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如 20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。

物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性; 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物

与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是 PCR 失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR 扩增是不会成功的。

PCR假阳性, 英文PCR false-positive, 是指在没有目标DNA或RNA的情况下，PCR检测结果错误地显示为阳性。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

PCR假阴性的原因可能由多种因素导致，美格君认为主要包括实验污染、试剂污染、PCR扩增的非特异性反应或仪器的误读。

PCR假阳性的常见原因：

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行 PCR 扩增时，扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出 PCR 产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。

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