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什么是荧光通道?荧光基团有哪些?​FITC DAPI FAM Cy5的区别和用途

作者:分子检测

分子检测技术

荧光通道的区别

什么是荧光通道?

荧光通道指的是针对每一种荧光的检测器,比如在一个实验管中设计多个颜色的荧光反应,分别针对多个靶基因。每个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱,每一个针对不同颜色的检测器,就是一个通道。

荧光基团的种类和用途

荧光基团类型主要有以下几种:


FITC

FITC( fluorescein isothiocyanate),具有**性标记生物分子的独特检测性能,可用于检测或跟踪共轭物与其他生物分子的相互作用,是应用最广泛的荧光素,有吸湿性。

异硫氰酸荧光素FITC常作为荧光探针应用于制备分子生物学或糖类聚合物的结合物分子,例如葡聚糖、壳聚糖、活性基团等。FITC常用作蛋白质或多糖的不同底物的标记试剂,以及标记抗体(IgG)以及其它免疫应用。其异硫氰酸基团可与蛋白的氨基末端或者伯胺反应从而实现包括抗体,凝集素在内的蛋白标记。除了用作蛋白质标记物,还可用作蛋白质荧光示踪剂,标记抗体用以快速鉴定病原体,以及用于蛋白质和多肽(HPLC)的微量测序。


FITC的碳酰胺键可与抗体蛋白上的赖氨酸氨基结合,形成FITC-蛋白质结合物,即荧光抗体或荧光结合物。抗体分子最多可标记15~20个FITC分子。标记的抗体仍能保持与相应抗原结合的能力,在荧光源紫外线或蓝紫光的刺激下产生黄绿色荧光,通过荧光显微镜观察或使用流细胞仪进行分析,从而定性、定位或定量抗原。


DAPI

DAPI,中文是 4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-二氨基苯甲酸,英文是4,6-diamino-2-phenyl indole,用于活细胞和固定细胞的染色


Texas Red

Texas Red,通常用于标记和检测生物分子,如蛋白质、抗体、核酸或其他生物分子,以进行生物学研究和实验室应用。可用于细胞样本的组化染色,常用于荧光显微镜和免疫组化实验中。


Cy5

Cy5,   Cyanine5(Cy5)染料是一种明亮的远红色荧光染料,其激发非常适合633nm或647nm激光线。与其他荧光团相比,使用诸如Cy5染料的长波长染料的显著优点是生物样品在该光谱区域中的低自发荧光。Cy5荧光团也是亲脂性神经元和长期Dil细胞追踪试剂的基础材料,该试剂将烷基尾部(≥12个碳)附加到核心荧光团上。


FAM/SYBR GREEN

FAM/SYBR GREEN(荧光素/ SYBR Green I),通常用于测量DNA浓度和定量PCR实验中


VIC/HEX/TET

VIC/HEX/TET(viability dye 5, viability dye 6, tetramethylrhodamine)通常是绿色或黄色荧光,常用于细胞活力测定。


除了以上常见的激发荧光基团外,还有TET、HEX、JOE、ROX等。


1996年,美国Applied Biosystems公司推出了荧光定量Rt-PCR技术 Real-time Quantitative PCR,简称qPCR,   qPCR技术发展由单一的染料染色法到特异性更高的探针法,从只能检测单一波长到可以检测多种波长光源被广泛使用的多重PCR技术。


而FAM通道、VIC通道、Cy5通道等多重PCR是在TaqMan荧光探针连接相应的激发荧光基团FAM、VIC、Cy5来实现的。


下面的表1和表2美格君总结了48种荧光基团的特点,包括波长和荧光颜色。


荧光基团中文名称激发波长发射波长荧光颜色
Hydroxycoumarin
325386blue
methoxycoumarin
360410blue
Alexa fluor
345442blue
aminocoumarin
350445blue
Cy2
490510green (dark)
FAM5/6-羧基荧光素495516green (dark)
Alexa fluor 488
494517green (light)
Fluorescein FITC异硫氰酸荧光素495518green (light)
Alexa fluor 430
430545green (light)
JOE2,7-二甲-4,5 二氯-6-羧基荧光素520548黄色
TET四氯-6-羧基荧光素521536绿色
Alexa fluor 532
530555green (light)
HEX六氯-6-甲基荧光素535556green (light)
VIC绿色荧光蛋白538554黄色
Cy3
550570yellow
TRITC
547572yellow
Alexa fluor 546
556573yellow
Alexa fluor 555
556573yellow
R-phycoerythrin (PE)
480;565578yellow
Rhodamine Red-X
560580orange
Tamara
565580red
Cy3.5 581
581596red
Rox羧基-X-罗丹明575602red
Alexa fluor 568
578603red
Red 613
480;565613red
Texas Red德克萨斯红615615red
Alexa fluor 594
590617red
Alexa fluor 633
621639red
Allophycocyanin
650660red
Alexa fluor 633
650668red
Cy5花菁染料650670red
Alexa fluor 660
663690red
Cy5.5
675694red
TruRed
490;675695red
Alexa fluor 680
679702red
Cy7
743770red

表1.   常用荧光基团的颜色和波长大全                                          美格生物数据


荧光基团中文名称激发波长发射波长荧光颜色
DAPI4',6-二脒基-2-苯基吲哚345455blue
Hoechst 33258
345478blue
SYTOX blue
431480blue
Hoechst 33342
343483blue
YOYO-1
509509green
SYTOX green
504533green
TOTO   1, TO-PRO-1
509533green
SYTOX orange
547570yellow
Chromomycin A3
445575yellow
Mithramycin
445575yellow
Propidium   iodide
536617red
Ethidium   bromide493620red

表2.   用作核酸探针的荧光基团波长                                    美格生物数据


以上只是常用的荧光基团,至于PCR仪上会选什么基团,除了涉及不同公司的知识产权外,主要还是要考虑减少基团之间相互干扰。


因为荧光基团波长会有部分重叠。比如在某些仪器有HEX通道,而使用的扩增试剂没有相应的荧光基团。那么波长相近的光就会被HEX通道检测到,从而影响荧光曲线。


荧光基团波长.jpg


图1 常用荧光基团的波长图比较


淬灭基团的作用

有激发基团就会有淬灭基团,淬灭基团的作用就是通过物理或化学作用使相应的荧光基团荧光淬灭。常用的淬灭基团有BHQ系列、TAMRA、DABCYL等。


淬灭基团

中文名称

BHQ-1

BHQ-1羧酸

BHQ-2

BHQ-2羧酸

BHQ-3

BHQ-3羧酸

TAMRA

羧基四甲基罗丹明

DABCYL

4-(4-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸

表3.   部分荧光淬灭基团                         美格生物数据


不同的试剂生产商会选择不同的荧光基团及淬灭基团。


荧光基团和淬灭基团在核酸检测产品开发中的实际应用

荧光基团和淬灭基团广泛应用于分子检测产品的开发。

例如,Pluslife新冠病毒COVID-19核酸检测试剂,其报告荧光基团是FAM、VIC、Cy5,淬灭基团FAM、VIC选择是BHQ1,Cy5选择是BHQ2。

不同的荧光通道就是用不同的荧光基团连接荧光探针用于检测不同的基因。

荧光通道的分配:

FAM通道检测N基因、VIC通道检测ORF1ab,Cy5通道检测内标基因。


表2. 实时荧光RT-PCR引物序列


引物和探针               序列(5'-3')                                                                               扩增片段


WH-NP-F2           ATTACAAACATTGGCCGCAAAT                                                    68 bp

WH-NP-R2           GCGCGACATTCCGAAGAA   

WH-NP-P2           FAM-AATTTGCCCCCAGCGCTTCAGC-BHQ1

WH-1ab-F1          TGACATAGAAGTTACTGGCGATAGTTG   

WH-1ab-R1          TTGCTACCTGCGCATTAATATGA                                                     131 bp

WH-1ab-P1          VIC-AGTTGAAAACATGACACCCCGTGACCTTG-BHQ1

RNP-Forward-2    AGATTTGGACCTGCGAGC                                                             81 bp

RNP-Reverse-2     ACTGAATAGCCAAGGTGAGC

WRNP-probe-2    Cy5- TCCACAAGTCCGCGCAGAGC-BHQ2


美格生物部分热销试剂价格

试剂盒名称编码容量大小试剂价格
Magicscript 耐热逆转录酶 IIA001S100µl, 200U/µl498
Magicscript RNA酶抑制剂A002S100µl, 40U/µl320
Magicscript 耐热逆转录酶 IIIA003S100µl, 200U/µl1580
Rnase H(E.coli)A004S250U320
一步法RT-qPCR预混液IIA014S100T798
抗体修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶(带基础 buffer)A016S250U, 5U/µl385
Taq 1.0 DNA 聚合酶(带基础 buffer)A015S250U, 5U/µl190
化学修饰热启动 Taq 1.0 DNA 聚合酶(带基础 buffer)A017S250U, 5U/µl385
CRISPR Cas12a (Cpf1)C001S70pmol/盒580
CRISPR Cas9C002S70pmol/盒489
CRISPR Cas12bC006S100pmol/盒1480
CRISPR Cas13aC005S100pmol/盒1280
CRISPR Cas14aC015S100pmol/盒1280
T7 Endonuclease IC007S250U/盒549
单链DNA荧光报告探针C009S50 test139
单链RNA荧光探针C011S50 test239
耐热 Rnase HIIA006S250U1299
2X LAMP Amplication Mix(with dye)F001S50T1299
鼠尾基因型鉴定试剂盒A010M100次498


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