小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

作者：Waleed Abu Al-Soud,Søren J. Sørensen&Hans Bisgaard来源：Nature

人类肠道微生物群的组成在生命的最初几年内成熟。据推测，这一时期的微生物成分会导致免疫失调，并可能导致哮喘。丹麦科学家Hans Bisgaard团队通过将690名受试者生命**年的16S rRNA基因扩增子测序的肠道微生物组成与随后的哮喘风险相关联，表明微生物组成不成熟的1岁儿童在5岁时患哮喘的风险增加。这种联系只在哮喘母亲所生的孩子中才明显，这表明在生命的**年缺乏微生物刺激会引发他们的遗传性哮喘风险。相反，在这个时期肠道微生物群的充分成熟可能会保护这些儿童。

实验设计

1、样品采集、DNA提取和测序

分别在婴儿出生后的第1周、第1个月及第1年时采集其粪便样品，提取粪便基因组DNA序列。使用V4区引物505F和806R对16S rRNA基因进行扩增。将PCR产物（浓度≥6 ng/μL）稀释为3-6 ng/μL，加上测序引物和接头，使用Illuimina MiSeq系统，MiSeq Reagent Kits v2试剂盒，进行 2 × 250 bp双端测序。

2、数据处理及统计分析

对测序序列进行质控和组装。使用R语言对数据进行分析，对微生物α-多样性和β-多样性、各层级微生物的种类和丰度进行计算和统计。将16S测序数据上传Sequence Read Archive数据库，收录号号为PRJNA417357。

实验结果

1. 1岁期间儿童肠道微生物群的结构变化

在出生第1年，儿童肠道微生物组成的差异非常大，这些差异包括微生物多样性、复杂性及优势菌种的变化。研究人员收集690名儿童的1696份粪便样品，并对样品进行16S测序。这些样品中共聚类到3651个OTUs，平均每个样品中有116个，其中的优势菌为拟杆菌属、双歧杆菌属和韦荣球菌属。在1周和1月龄婴儿粪便中，微生物α-多样性无显著变化，到1岁时显著增加（图 1a）。婴儿在1月和1岁龄时的微生物β-多样性及丰度在前20的物种变化**。

小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

图1.

2. 微生物种群类型及其成熟情况由年龄决定

使用聚类分析法（Partitioning around medoids, PAM）区分粪便样品类型，以研究微生物群落组成差异。该法将样品分为2种可以表现出取样时儿童年龄大小的微生物群落类型（图 1b）。PAM簇1主要由1周和1月龄婴儿粪便样品组成（N=1019），PAM簇2则主要由1岁龄儿童的粪便样品组成（N=677）（图 1c）。PAM簇1的代表菌种分别是肠杆菌属、葡萄球菌和链球菌等，PAM簇2的是粪杆菌属、拟杆菌等。PAM簇2的 α-多样性比PAM簇1的高。β-多样性分析显示1月龄婴儿的微生物种群多样性与1岁龄儿童的PAM聚类无关。

在一系列环境因子中，与PAM簇显著相关的只有家庭中是否存在大的孩子。PAM簇1中，孩子家庭中有大孩子的只占24%（N=8），而PAM簇2中，孩子家庭中有大孩子的比例达到57%（N=334）。

小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

图2.

3. 微生物类群结构与随后的哮喘相关联

研究人员分析了微生物群落构成和后来哮喘的发展之间的关联性。很多儿童在1岁时会周期性出现类似哮喘的症状，但这种症状在学龄前会随着年纪的增加而痊愈。648名儿童中，到5岁时仍患哮喘的比例占9%（N=60）。所有时期的患病风险和α-多样性都不存在显著关联。1岁龄患者和健康儿童的微生物群落β-多样性有显著差异。有微生物-哮喘关联性的147名儿童的母亲均为哮喘患者，而健康母亲生育孩子则无这种关联（图 2）。父母的哮喘状态与儿童微生物的α-、β-多样性无关。

小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

图3.

4. 1岁龄儿童肠道微生物丰度与后来的哮喘相关

研究人员对1岁龄儿童粪便样品中最常见的20种微生物进行丰度检测，以验证后来患哮喘是否与早期特殊的细菌种类有关。结果表明，与健康儿童相比，5岁时有高风险患哮喘儿童的韦荣球菌属的丰度较高，罗斯氏菌等的丰度较低。若母亲患病，则其小孩哮喘的发展与8种细菌有显著关联（图 3），负相关的有粪杆菌属、双歧杆菌属等，正相关的仅有韦荣球菌属（图 3）。如果儿童患了哮喘，将其在1岁时丰度低的细菌当作是健康成型肠道微生物群落结构的决定成分。1周龄和1月龄婴儿粪便中丰度前20的细菌物种与哮喘的形成无关。由此可见，1岁龄和5岁龄儿童的微生物构成与哮喘的形成之间有很强的可预见性。

小儿肠道微生物构成的成熟与哮喘的关系

图4.

5. 1岁龄儿童肠道微生物群落类型和成熟程度低与后来患哮喘相关

研究人员用微生物PAM簇来指示群落的成熟情况，以验证微生物是否决定着哮喘形成。将儿童1岁龄时微生物是PAM簇1的与已转变成PAM簇2的作比较（图 4）时发现，如果1岁龄时微生物群落类型是PAM簇1，儿童患上**性哮喘的风险增加了2.87倍，而PAM簇与暂时性哮喘无关联。同时，研究人员还使用另外一种方法，微生物-年龄z值(microbiota-by-age z-scores, MAZ)来指示群落的成熟情况。同样，低MAZ值的儿童患上**性哮喘的风险也有所增加。

肠道微生物群落类型是PAM簇1或者MAZ值低的1岁龄儿童患上类似哮喘疾病的次数将比PAM簇2的或MAZ值高的儿童多，患病风险比例分别为1.54和1.26。

为探讨这些结果是否具有特定的哮喘表型特征，研究人员将儿童的过敏反应细分。不管儿童是否患有哮喘，或者有没有过敏反应，他们在1岁龄时的微生物β-多样性皆存在显著差异。致敏哮喘的表型与β-多样性的倾移有关。

研究总结

1. 对母亲是哮喘患者的儿童来说，他们1岁龄时的肠道微生物和后来患上哮喘之间有很强关联性。

2. 家里有兄弟姐妹的儿童能够完善自身的肠道微生物。

3. 有高风险患哮喘的婴儿出生后，建议用特殊的益生菌补充剂进行疾病预防。

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参考文献

Maturation of the gut microbiome and risk of asthma in childhood

Jakob Stokholm,Martin J. Blaser,Jonathan Thorsen,Morten A. Rasmussen,Johannes Waage,Rebecca K. Vinding,Ann-Marie M. Schoos,Asja Kunøe,Nadia R. Fink,Bo L. Chawes,Klaus Bønnelykke,Asker D. Brejnrod,Martin S. Mortensen,Waleed Abu Al-Soud,Søren J. Sørensen&Hans Bisgaard