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用CRISPR-Cas9为基础的全基因组技术筛选弓形虫

作者:Saima M Sidik,Diego Huet&Sebastian Lourido来源:Nature

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CRISPR-Cas9蛋白为基础的全基因组技术筛选弓形虫

顶复门寄生虫Apicomplexan parasites,例如弓形虫(Toxoplasma gondii),会引起人和家畜广泛的发病率和高的死亡率,深入了解其分子生物学是必要的。

虽然靶向基因中断技术已经用于apicomplexans寄生虫很久,但这种方法不容易扩展到整个基因组。

我们最近利用CRISPR Cas9基因编辑技术、混合形式破坏了弓形虫的核蛋白编码基因。

该方法依赖于一个向导RNA文库转染进入构成CRISPR Cas9蛋白表达的寄生虫。

在这里,我们绘制了一个完整的工作流程,例如筛选,包括指导RNA文库制备、受体菌株的生长和测试,变体群体的生成,筛选的培养条件,基因组DNA文库的制备,引导RNA基因的下一代测序技术,分析检测带来健康的基因。

这种利用crispr cas9蛋白的基因编辑方法可以用来扩展研究培养条件是如何影响寄生虫所需的基因序列的,这将有助于研究它们的代谢需要、宿主特性和耐药机制。

此外,通过操控筛选的背景数据,研究人员将能够了解基因的相互作用,这可能有助于发现寄生虫的基因组中的过剩或异位显性。

使用这种方法,全基因组筛选和分析可以在3周内完成,大约1个月后制备生成库和成长需要的细胞,这是一个发现Apicomplexan寄生虫重要功能基因的有力工具。

CRISPR CAS筛选程序的示意图

CRISPR CAS筛选程序的示意图。


克隆CRISPR库进入pU6-DHFR

克隆CRISPR库进入pU6-DHFR


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参考文献

CRISPR-Cas9-based genome-wide screening ofToxoplasma gondii

Saima M Sidik,Diego Huet&Sebastian Lourido


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