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用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统编辑体细胞基因组,建立精确的肿瘤模型

作者:Sandra Rodriguez-Perales, Jason T. Huse & Massimo来源:Nature

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CRISPR Cas9基因工程小鼠模型的最新改进有助于理解导致肿瘤发生和发展的分子途径。

为了适当的模拟肿瘤的自然史,有几个因素应考虑:

a. 人类肿瘤中被发现的相同的突变,最好是在其内源位点;

b. 在胚胎期和出生后发育期,除了常见或儿童肿瘤模型,基因改变应该保持沉默;

c. 突变基因应该在特定的靶组织或特定的细胞类型中表达,并且

e. 突变应该存在于有限数量的细胞中。

RCAS-TVA-CRISPR Cas9 系统可以在一个单一的模型中,概括所有这些特性。

许多不同的敲入TVA小鼠模型已发表,他们已被用来研究各种癌症:胶质瘤、髓母细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌。

培育任何的TVA小鼠系,敲入CRISPR Cas9‍蛋白,可以产生新的体细胞基因组编辑模型,用来研究各种类型的肿瘤。

作为一个原理论证,我们使用了两种不同的CNS特异性的TVA的转基因系(Nestin-tv-a和GFAP-tv-a),展现人脑胶质瘤中各种遗传变异的功能特性:

1. 从GBMs (TP53,CDKN2A和PTEN)中敲除一组反复丢失或突变的TSG

2. 对不同亚型胶质瘤中确认的基因重排

3. 在各种儿童和成人的胶质瘤中显示一个点突变(BRAFV600E)

对于TSG,我们选择了TRP53 ,CDKN2A和Pten,之前显示与PDGFB一起过表达,引发了高级别胶质瘤。

事实上,针对这些基因的gRNA共注射,导致高频率的GBM形成。

这些数据表明,为了TSG利益,将特定的癌基因驱动表达与gRNA结合,可以很快提供对肿瘤发生、发展过程所产生的贡献的信息。

此外,使用hUBC-CreERT2+/T或其他Cre诱导菌株,利用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统,不仅仅可以研究肿瘤的发生,还可以研究肿瘤进展和维持。

由于最近CRISPR-Cas9技术的进展,少量的小鼠模型已被开发来研究脑肿瘤。

用CRISPR Cas9蛋白编码的质粒,与靶向Nf1, Trp53和Pten的gRNA结合,通过对小鼠胚胎前脑的子宫内电穿孔技术(IUE),Zuckerman和Chen能够诱导高度侵袭性肿瘤,这些肿瘤有人类胶质母细胞瘤的组织病理学特征。

最近,Cook和同事们用腺病毒(Ad)载体表达CRISPR Cas9蛋白,在成年小鼠的大脑,产生 Bcan-Ntrk1重排。

我们认为使用IUE和AD进行神经胶质瘤CRISPR/Cas9建模,至少涉及两个关键问题:

第一,gRNA的传递时间的确定,靶细胞的特异性不足。

电穿孔是正常在E14.5或E15.5进行,妊娠期遗传改变可能不一定反映成人的胶质瘤生物学特征。

第二个问题是,来自组成型启动子的CRISPR Cas9酶的表达,它已被用于IUE和Ad研究,不允许以细胞类型特异性的方式编辑基因组,因此不限制胶质瘤假定源细胞的基因改变。

CRISPR Cas9系统已被用于人类和小鼠细胞模型的基因组重排。

融合基因转录可以导致至少四种不同的情况:

a. 癌基因过表达增加(如白血病的IgH-MYC)

b. 肿瘤抑制基因的反常(如儿童畸胎瘤的 CHEK2-PP2R2A)

c. 新的异常蛋白的产生(如白血病BCR-ABL1)

d. 以上情况的组合(如血管中心性胶质瘤的MYB-QKI)

我们观察到,在人脑胶质瘤患者和我们的小鼠模型中,NTRK1基因融合导致NTRK1转录的过度表达。

最有可能的是,高水平的NTRK1转录导致TrkA受体激酶的水平显著,这导致了致癌活性的融合。

事实上,我们观察到Bcan-Ntrk1肿瘤对pan-TRK抑制剂entrectinib敏感。

我们为BRAF V600E突变生产了第一个CRISPR Cas9模型。

携带BrafV637E敲入突变(同源于人的 BRAFV600E突变等位基因)的小鼠肿瘤展现了某些特征,类似上皮样细胞的胶质母细胞瘤 (E-GBM),一些肿瘤细胞显示了上皮样特征和松散性。

我们发现BrafV637E肿瘤对dabrafenib治疗相当敏感,这表明该抑制剂可能代表这些胶质瘤类型的可能的治疗方法。

此外,我们已经证明,获得的dabrafenib抵抗可以用MEK抑制剂trametinib克服。

总之,我们已经开发了一个非常强大和多功能的小鼠模型,它结合了CRISPR Cas9基因组编辑技术与RCAS-TVA系统的体细胞基因组转移能力。

我们相信这样一个灵活的模型将大大加快精确癌症模型的生成,从而加速新靶向治疗的临床前试验。

用RCAS-TVA-CRISPR-Cas9系统编辑体细胞基因组,建立精确的肿瘤模型

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参考文献

Somatic genome editing with the RCAS-TVA-CRISPR-Cas9 system for precision tumor modeling

Barbara Oldrini, Álvaro Curiel-García, Carolina Marques, Veronica Matia, Özge Uluçkan, Osvaldo Graña-Castro, Raul Torres-Ruiz, Sandra Rodriguez-Perales, Jason T. Huse & Massimo Squatrito


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