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利用CRISPR-EZ技术进行有效的小鼠基因编辑

作者:Andrew J Modzelewski, Sean Chen, Brandon J Willis

CRISPR/CAS9技术已经以前所未有的精度、效率和易用性改变了小鼠基因组编辑。

然而,目前将CRISPR试剂微注射到原核阶段胚胎的工作速率仍然是受限制的。

我们开发了核糖核蛋白(RNP)电穿孔受精卵(CyrPRE-EZ)技术,该技术以电穿孔为基础,在效率,简单性,成本和产量等方面优于原核和细胞质显微注射

通过将预组装的Cas9/sgRNA RNPs导入原核阶段胚胎,快速且瞬时地进行编辑,最大限度地提高效率,同时最小化镶嵌性。

CRISPR-EZ通过使用一系列电脉冲,完全绕过微注射,以100%的效率递送RNPs。

在C57BL/6J和C57BL/6N小鼠品系中,CRISPR-EZ实现了100%的CAS9/单引导RNA(SGRNA)RNPs的递送,促进了插入或缺失突变、外显子缺失、点突变和小插入。

CRISPR-EZ大大超过了CAS9mRNA /sgRNA微量注射的编辑效率,约为成本的四分之一。

在高通量基因敲除小鼠项目(KOMP)系列的并列比较中,CRISPR-EZ始终优于微注射。

我们提供了一个优化的协议涵盖sgRNA合成,胚胎收集,RNP电穿孔,小鼠的产生,和基因分型策略。

CRISPR-EZ使用通常可用的试剂和设备,只需要基本的胚胎处理技能,并且已经通过广泛的靶标和编辑方案进行了全面测试,使得我们的协议容易适应许多研究者。

CRISPR-EZ是一种强有力的工具,它代替了显微注射作为最常用的编辑方案的标准小鼠基因组编辑方法。

使用CRISPR-EZ,一个具有基本胚胎操作技能的研究生水平的研究者可以在6周内获得转基因小鼠。

总之,CRISPR-EZ是一种简单、经济、高效和高通量的技术,可潜在地应用于其他哺乳动物物种。

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CRISPR-EZ技术工作流程


协议概述

使用CRISPR-EZ,可以在1至2周内快速地在培养的小鼠胚胎中直接检测sGRNAS,随后在1个月内产生编辑过的小鼠(图1B)。

该协议可分为七个主要阶段,包括:

sgRNA设计(步骤1和2);

sgRNA合成(步骤3—15);

超数排卵和交配(步骤16~19);

胚胎培养、收集和处理(步骤20~28);

RNP组装和电穿孔(步骤29~34);

胚胎培养和基因型分型(步骤35a)

输卵管转移(步骤35b)。


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参考文献

Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology

Andrew J Modzelewski, Sean Chen, Brandon J Willis, K C Kent Lloyd, Joshua A Wood & Lin He


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