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利用Tild CRISPR技术进行高效和精确的基因敲入作者：Xuan Yao, Meiling Zhang, Xing Wang等人来源：Cell CRISPR/CaS9介导的基因组编辑技术极大地促进了原位基因突变细胞和组织的校正。 但是，通过同源重组（HR）敲入序列的靶向效率一般较低。 最近，非同源末端连接（NHEJ）或微同系物介导的末端连接（MMEJ）为基础的方法提到，在进斑马鱼和小鼠中，在没有同源臂（HA）或短HA（5 - 25 bp）的转基因供体的体内裂解促进CRISPR介导的靶向整合。 此外，两个研究组织报告了同源介导的末端连接（HMEJ）为基础的策略，用800-bp的HA，在体内裂解的转基因供体，实现了强劲的DNA敲入。 然而，有条件等位基因的小鼠--最有用的基因工程模型--以及由DNA敲入所修饰的人类胚胎，还没有由这些新的方法产生。 我们研究了通过两个限制性内切酶，先对转基因供体体外裂解，形成含长HA的线性供体（称为TiLD供体）， 看是否可以进一步提高敲入效率。 我们比较了TiLD供体与两种常用的其他供体的效率：一个是HMEJ供体（单导RNA靶点+800-bp的HA）和一个HR供体（只有800-bpHA）（图1A）。 我们融合了一个 p2A-mCherry报告基因到最后一个密码子的Actb基因（图1A）。 每种类型的转基因供体靶向ACTB基因，与CaS9 mRNA和SGRNA一起注射到小鼠受精卵。将注射的合子培养成囊胚（图1B）。 敲入效率由囊胚中的mCherry荧光信号进行评估（图1B）。有趣的是，我们观察到含Tild供体的mCherry+囊胚的比率（33.2%）高于HMEJ供体（20.5%）或HR供体（0%）（图1C）。 将Tild CRISPR处理的胚胎移植到假孕小鼠后，成功地在六个不同的位点获得了基因修饰敲入小鼠，包括在DH位点（6/29）和CDX2位点（31/57）的mCherry整合的小鼠，在Sp8位点（10/35）的Cre整合，在Rosa26位点(2/29)的CAG-LSL-ChR2-Tdtomato (6.0 kb)整合， Nr3c2位点 (3/16)和Lhx6位点(4/12)的条件floxed等位基因。 通过DNA测序分析证实了这些基因编辑小鼠的精确整合，并且所有的敲小鼠都能够通过生殖系传递。 这种新方法，我们称之为Tild CRISPR（用线性dsDNA-CRISPR靶向整合），一种靶向策略，将扩增的PCR或精确切割酶含800-bp同源臂的转基因供体，体外线性化DNA，与CaS9 mRNA和单导RNA注射到小鼠受精卵中，有效地实现了体内小鼠、人胚胎以及小鼠大脑的DNA靶向整合。 与现有的靶向策略相比，该方法在小鼠胚胎和脑组织中获得了更高的敲入效率。重要的是，Tild-CRISPR方法也比人类胚胎中的基于HR的方法产生高达12倍的敲入效率，使其适合于研究体内的基因功能和开发潜在的基因治疗。
图一
floxed:被两个LoxP点位夹着 参考文献 Tild-CRISPR Allows for Efficient and Precise Gene Knockin in Mouse and Human Cells Xuan Yao, Meiling Zhang, Xing Wang, Wenqin Ying, Xinde Hu, Pengfei Dai, Feilong Meng, Linyu Shi, Yun Sun, Ning Yao, Wanxia Zhong, Yun Li, Keliang Wu, Weiping Li , Zi-jiang Chen, Hui Yang 相关阅读 |
