涡流助力临床规模的血小板生产

输血是一种最常见的细胞治疗形式。输血依赖于志愿者献血，但在不久的将来，捐赠者的供给预计不会满足病人需求。科学家正在研究替代血小板源。

来自人类诱导多能细胞（hiPSCs）的血小板在体外生成，有望补偿供体依赖的输血系统。

然而，由于hiPSC衍生巨核细胞（hiPSC-MKs）释放的血小板量低，仍未达到临床上所需血小板数量。

包括我们的一些小组已经提出了人类诱导多能干细胞（hiPSCs）作为这样的来源，但是实际还没达到体外制造200—3000亿个血小板的要求，这是用于一次输血需要的数量，要具有真正的循环血小板的功能特性。

通过引入转基因建立的可扩展和可低温保存的巨核细胞系已被用于巨核细胞生成。

我们已经证明，来源于hiPSCs的永生化巨核细胞系(imMKCLs），可以通c-MYC、BMI1和BCL-XL的过度表达而被有力地扩展，而强力霉素可以用来刺激细胞的增殖（DOX-on）和成熟（DOX-off）。

我们将涡流作为在体内血小板成熟的物理调节器，可用于涡流可控生物反应器中。

涡流能量作为一个决定因素，可以将规模扩大到8L, 从hiPSC-MKs产生1000亿级的血小板，满足临床要求。

涡流促进IGFBP2、MIF和Nardilysin巨核细胞的释放，以促进血小板脱落。在两种动物模型中，hiPSC-血小板显示出真正的人类血小板的特性，包括输血和循环止血能力。

这项研究提供了一个概念，协调的物理-化学机制促进血小板产生和体外血小板制造的创新策略。

在本报告中，我们观察体内血流动力学，发现涡流是血小板释放的一个重要物理因素。

基于这一发现，我们开发了一个基于涡流的生物反应器， VerMES，通过往复垂直运动，并确定涡流能量作为物理参数，保证一致的血小板产量独立于反应器规模和培养体积。

此外，我们发现新的化学因子在促血小板生成中有助于成熟巨核细胞的重塑和血小板的脱落。

因此，放大到临床相关系统中，可以有效地生产真实的血小板。

滋养独立的imMKCL培养系统

为了体外生产与临床应用兼容的人血小板，我们试图为imMKCLs开发一种独立于滋养层细胞的培养系统（图1A）。

扩增阶段培养基辅以鸡尾酒A，其中包括强力霉素、干细胞因子（SCF）和TA-316（血小板生成素TPO模拟小分子,图1B）。

在这个阶段，在15～20天的培养中，首先在旋转烧瓶中，然后在波动袋系统中通过轻微摇摆运动,imMKCL数量从5×10^6增加到5×10^10（图1C）。

imMKCL显示稳定增殖超过70天，同时保留CD41+CD42B+表型。

我们筛选候选药物发现AHR拮抗剂STEMREGIN 1（SR1），加上岩石抑制剂，Y-27632，最有效地促进了在无饲养层条件下的血小板生成。

对于血浆含量，以前使用15%胎牛血清或15%人血清，但我们发现5%人血浆足以成熟期。较低的人体血浆含量降低了成本,并**限度地减少了动物源性成分的使用。

我们还注意到，与静态培养皿（10毫升体积）相比，摇瓶（E125烧瓶：25毫升体积）导致较高的血小板产量和更好的PAC-1结合刺激，这表明液态培养条件下，物理应力水平摇动进一步增强血小板生成。

体内血小板成熟中的涡流

对于在imMKCL成熟期的生物反应器和imMKCL最终释放的血小板，我们最初测试了WAVE生物反应袋，这是一个基于摇摆袋的系统。

然而，虽然该系统能够在20L规模（细胞分裂阶段）持续增殖imMKCL，但产生的血小板数量和质量非常低。进一步的调查使我们认识到，该系统缺乏足够的物理应力。

涡流诱导体外血小板成熟

我们发现，VerMES,一个垂直往复运动型液体培养生物反应器，让血小板有效生成。

2.4L VerMES生物反应器包括两个椭圆形混合叶片，其固定在水平轴上，与动力轴线成直角。叶片以**300毫米/秒的速度重复上下往复运动以产生涡流（图3A和S3A）。

通过调整在8L VerMES（冲程，40毫米；速度150毫米/秒）中确定的涡流能量和剪切应力的**范围，我们成功地用三个imMKCL克隆获得了1000亿个血小板，所产生的血小板的质量与2.4L的质量相当。

通过我们的体外生产协议产生的iPSC血小板比使用饲养皿细胞在培养皿中生产的血小板表现出更好的功能，并且接近供体血小板的水平，包括体内止血和循环活性。

我们的研究显示：

涡流激活小鼠血小板的形成。

以涡流为基础的生物反应器使血小板成熟具有高产量和高质量。

优化的涡流能量和剪切应力参数是扩增的关键。

通过可溶性因子IGFBP2、MIF和NRDC可以检测细胞自主机制。

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参考文献

Turbulence Activates Platelet Biogenesis to Enable Clinical Scale Ex Vivo Production

Yukitaka Ito, Sou Nakamura, Naoshi Sugimoto, Tomohiro Shigemori, Yoshikazu Kato, Mikiko Ohno, Shinya Sakuma, Keitaro Ito, Hiroki Kumon,

Hidenori Hirose, Haruki Okamoto, Masayuki Nogawa, Mio Iwasaki, Shunsuke Kihara, Kosuke Fujio, Takuya Matsumoto, Natsumi Higashi, Kazuya Hashimoto,

Akira Sawaguchi, Ken-ichi Harimoto, Masato Nakagawa, Takuya Yamamoto, Makoto Handa, Naohide Watanabe, Eiichiro Nishi, Fumihito Arai, Satoshi Nishimura,

Koji Eto

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