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肠息肉的黏膜微生物学揭示了结肠直肠癌的生物标志物

作者:Marco Ventura & Francesca Turroni来源:Nature

广州美格生物在微生物研究领域有着丰富的经验。咨询热线:18027152056


人类肠道保留了复杂的微生物生态系统,它对宿主健康起着至关重要的作用。一些研究表明,肠道生物失调对威胁生命的肠道疾病的形成有影响,如大肠癌。

腺瘤性息肉是异常组织生长的结果,它是良性的,但根据其异型增生的分级,被认为与结直肠癌发展的高风险相关。

腺瘤性息肉或腺瘤长期以来被认为是结直肠癌的前驱物。结直肠癌(CRC)是世界范围内最常见的**癌症之一,因此也是发达国家的主要死亡原因之一。

众所周知,在某些情况下,腺瘤性息肉可能演变为结直肠癌,即使目前尚无科学证据明确地证明多少年以及退化的确切原因是什么。

到目前为止,越来越多的研究强调了息肉大小、组织学与该病理向CRC的进展之间的直接关系。此外,促进息肉的恶性转化的分子原因基本上是未知的。

已经调查了息肉参与癌症发展的几个因素,如遗传学、表观遗传学、饮食、生活方式、肥胖、酒精摄入和吸烟。

近几十年来,已经明显的显示肠道细菌及其代谢产物可能通过各种机制参与大肠癌的触发或进展,

包括活性氧自由基和其他基因毒素的产生,酚类化合物和吲哚的产生,以及饮食因素转化为致癌物和肿瘤促进剂,在宿主上皮细胞中诱导促炎和致癌途径等等。

各种研究探索了患有CRC的个体的肠道微生物群,从而鉴定了一系列与癌症发生相关的不同细菌群,包括幽门螺杆菌、脆弱类杆菌、核梭杆菌、各种致病性大肠杆菌,解没食子酸链球菌Streptococcus gallolyticus和梭菌属的成员。

虽然筛查和生活方式在早期发现和预防结直肠癌中起着重要作用,但是确定新的**工具,特别是早期发现肿瘤是非常重要的。先前的研究比较了健康人粪便样本与息肉患者的肠道微生物组成。

然而,粪便微生物群仅部分代表与肠粘膜直接接触的原生微生物群。

因此,为了评估接受息肉病变结肠黏膜切除术的受试者的肠道内原生微生物群的作用,我们进行了一项从健康黏膜和来自相同受试者的息肉收集肠道活检的初步研究。

在这些样本上,我们基于16S rRNA微生物谱数据,16s的测序数据,进行了包含腺瘤性息肉重建的微生物群组成,以及公开可获得的结直肠癌宏基因组数据的荟萃分析,以寻找息肉和结肠癌之间出现的常见微生物。


招募试验研究的病人

在意大利Parma大学医院胃肠和消化内镜科,12名患者在获得知情同意后登记,进行试验。

排除标准包括:年龄>90岁、全结肠镜检查检查中无结肠息肉、过去3周内使用抗生素、不能签署知情同意书。

用内镜活检钳采集同一受试者结肠粘膜息肉(CMP)和健康边缘组织(HMT),共采集24个标本(受试者平均年龄:66±12岁),立即在_80℃条件冷冻,保存至进一步加工、DNA提取。

按照设备的说明,使用Environmental RNA/DNA Isolation Kit Sample (Qiagen) ,从每个样品中提取DNA。

本研究方案经Parma省伦理委员会批准,所有实验均按照有关指导方针和规章进行。

每个患者从人口统计学数据,疾病指标和治疗的水平方面进行表征。

组织学分析表明,四个是腺瘤性息肉和八个是增生性息肉。

所有腺瘤性息肉均见于男性,其余增生性息肉均来自三男五女。

用12例结肠息肉(CMP)粘膜标本及相应的健康边缘组织(HMT)标本(共24例)对12例住院患者进行了16S rRNA基因测序分析,评估了微生物的分类学特征。

肠息肉的黏膜微生物学揭示了结肠直肠癌的生物标志物,HMT和CMP组中的多样性HMT和CMP组中的多样性。



16s测序分析研究方法

16S rRNA基因扩增

针对16S rRNA测序的V3区域,利用引物对Probio_Uni (5′-CCTACGGGRSGCAGCAG-3′)/Probio_Rev (5′-ATTACCGCGGCTGCT-3′),进行16S rRNA基因扩增。

16S rRNA基因扩增子的MiSeq测序

16S rRNA微生物图谱分析

统计分析

使用SPSS软件完成统计分析。

定量PCR

数据沉积


16s测序结果分析讨论

HMT和CMP样品的16S rRNA谱分析


与HMT和CMP相关的类群

为了进一步确定CMP和HMT患者之间微生物群组成的差异,我们对30个分类群进行了重点研究。

与CMP样品相比,HMT中放线菌门如双歧杆菌属的成员的丰度较高。

众所周知,双歧杆菌是典型的肠道微生物,据推测对人类健康有积极影响,最近它们的缺失与各种疾病状况有关。

此外,粪杆菌属和IBD患者中发现的类细菌类群在HMT样品中含量较高,而类细菌类群在IBD患者中含量较低。

此外,Romboutsia taxa是HMT与CMP样品中相对丰度最高的属。

值得注意的是,Romboutsia是最近描述的一种细菌属,通常在人体肠道中被鉴定,通常与患者的健康状况有关。

与息肉相关的粘膜中这一特定属成员的急剧减少可能代表了一种疾病状况的微生物指示物。

相比之下,CMP样品中通常与癌变相关的幽门螺杆菌和克雷伯杆菌的高度存在,反映了一种典型的疾病状况。

研究结果加强了Romboutsia在维持宿主健康状态中可能扮演关键角色的观念,并使得该分类群成为非常有价值的肠道生物标志物。


可能的癌症生物标志物的鉴定

为了加强我们的分类学观察和扩大CMP数据库,我们对存放在公开NCBI数据库中的16S rRNA为基础的息肉相关宏基因组数据集进行了调查和选择。

然而,公布的息肉相关宏基因组数据集是基于粪便样品。

在此背景下,值得一提的是,先前对健康患者或患有直肠出血的儿童的研究表明,属于同一个体的粪便和粘膜样本显示出非常不同的微生物组成。

为了避开来自息肉相关活检的数据缺失的问题,我们决定使用人类CRC数据集。

我们从四个公开可用的CRC生物项目中检索到293个样本。

总的来说,我们发现我们在HMT和CMP样品中检索到的趋势与健康组织HT和CRC样品中的趋势一致,显示出少量的微生物类群,

这些微生物类群可以被认为是早期检测肿瘤的细菌生物标志物,或者相反,反映了健康的状况。


QPCR定量检测结核杆菌梭杆菌

由于一些研究表明核梭杆菌的存在与大肠癌的形成和进展有关,因此用qPCR对所有24个样本(12例患者的HTM和CMP活检)测定了该物种的相对丰度。

初步数据表明,该物种不仅可被认为是**大肠癌的重要细菌生物标志物,而且可作为早期**息肉恶性移位的有价值的微生物标志物。

20180919B.jpg健康组织HT和CRC息肉组织CpT中的多样性。


测序数据分析结论

最近的发现表明,肠道疾病与微生物的改变相关。

在当前的试验研究中,我们比较了息肉或CRC患者与健康粘膜的粘膜样本中的细菌数量,表明与息肉相关组织相比,Romboutsia属在健康粘膜中更为丰富。值得注意的是,RMC在CRC组织中的相对丰度被大大降低。因此,我们可以认为,这种微生物属的缺失是粘膜改变的**个指标。

值得注意的是,这种微生物类群已经被其他肠道相关疾病观察到。


有趣的是,在测试的所有CMP样品中均未检测到Peptoclostridium属,而对HMT样品的分析表明,Peptostreptococcaceae科的U.m.数量相对较高。

我们的发现与荟萃分析的结果一致,我们在荟萃分析中将CMP样本与来自公开可获得的荟萃数据集的CRC样本进行比较。我们的宏基因组分析显示,与健康样品相比,CPT样品具有较高的梭杆菌属丰度。

有趣的是,梭杆菌属经常参与肿瘤的进展。

在属水平,我们确定了五个分类特征的健康组织HT和一个典型的CPT主题分类群。具体而言,健康样品中含有高丰度的拉氏囊藻科、拉氏囊藻属、粪杆菌属、钌梭菌属和亚圆柱菌,而CpT样品中则含有高丰度的弯曲菌。

在CRC粘膜和息肉相关标本中,属于弯曲杆菌属的细菌数量较高,这加强了弯曲杆菌与肠道病理发展的相关性。


肠道微生物包括非常复杂的微生物阵列,其组成变化已显示出影响人类健康状况。在CRC相关样本中明显改变其丰度的微生物参与者的鉴定可用来早期**恶性转化,以及鉴定息肉或CRC组织中缺失的保护性细菌。


总之,在这个试验研究中获得的数据使我们能够识别与息肉和/或CRC相关的可能的微生物标志物。

然而,这些发现需要通过大量样品的分析来进一步验证,以便进一步证实和充分表征CRC发展的这些潜在的微生物标志物以及有益细菌,并鉴定它们的功能和与宿主的相互作用。


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参考文献

Mucosal microbiota of intestinal polyps reveals putative biomarkers of colorectal cancer

Marta Mangifesta, Leonardo Mancabelli, Christian Milani, Federica Gaiani, Nicola de’Angelis, Gian Luigi de’Angelis, Douwe van Sinderen, Marco Ventura & Francesca Turroni


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