LAMP扩增技术、CAS蛋白、Taq酶、逆转录酶、RNase HII、基因分型检测


美格生物
MAGIGEN
TEL: 020-31607074   18028069151     Email: info@magigen.com
最新文章
生物技术及产业新闻

用CRISPR技术记录细胞活动情况

作者:Florian Schmidt, Mariia Y. Cherepkova & Randall J.来源:Nature

CRISPR-Cas细菌防御系统最著名的是它们被应用来切割特定的DNA序列。

但是这些系统的另一个特点是将来自不想要的入侵者的DNA片段整合到细菌自身的基因组中。

这些存储的序列提供了对被感染的永久“记忆”,如果再次遇到相同的入侵序列,则能够进行防御性反应。

在这种称为CRISPR阵列的结构中,核苷酸被添加到细胞的DNA中。阵列的序列在相同的重复序列和合并的片段之间交替,这被称为间隔物。

随着间隔物的获取,阵列变长,并且间隔物在阵列中的定位反映了插入间隔物的顺序。

几乎所有的CRISPR-CAS系统通过直接从捕获的入侵者DNA中获取外来遗传物质。

以前的一些研究工作利用CRISPR-Cas系统的这一特点,以被获取和存储的核苷酸序列的形式来记录信息。

例如,有一种方法用CRISPR-Cas为介导的外源提供的合成DNA的产物,按特定顺序来捕获序列。

间隔中的核苷酸的特定顺序随后被“解码”,将每个CRISPR阵列链接到序列图像中的像素。

另一项研究利用来自环境的化学信号来驱动控制称为质粒的环状DNA丰度的基因的表达。

随着质粒在细胞中的丰度增加,质粒成为新的间隔物的DNA片段的首选来源;这把化学信号与跟质粒DNA匹配的储存间隔物联系起来。

这项研究,为使用CRISPR-CAS来记录一个或几个基因的表达奠定了基础。

记录细胞内随时间推移所发生的转录事件,将有助于阐明分子事件如何导致复杂的细胞行为和状态。

然而,目前的分子记录技术只捕获一小部分定义的刺激。

最近,J. Platt团队使用CRISPR间隔物,来捕获细胞内RNA,并将其转化成DNA,从而实现基于DNA的转录信息的存储。

在大肠杆菌中,J. Platt团队发现,确定的刺激,如RNA病毒或任意序列,以及复杂的刺激,如氧化应激,导致可量化的转录记录,储存在细胞群体中。

转录记录能够对复杂的细胞行为进行分类和描述,并且能够识别协调不同细胞反应的精确基因。

将来,CRISPR间隔物获取介导的RNA记录,然后进行深度测序(Record–seq),可用于重建描述复杂细胞行为或病理状态的转录历史。

J. Platt和同事们专注于捕获入侵RNA而不是DNA的CRISP-Cas系统,设计了一个创造性的解决方案(图1a)。

20181009A.jpg

这些系统只需要两种蛋白质就能实现这一壮举,其中一种蛋白质制造RNA序列的DNA版本,这成为间隔物。

能够从RNA中产生DNA提高了这种DNA可用于记录RNA转录本的身份和丰度的可能性,从而捕获细胞的基因表达谱。

为了使用这些CRISPR-CAS系统,首先必须克服两个技术障碍。一个障碍是发现有效的RNA捕获Cas蛋白,因为先前表征的蛋白质在此任务中效率低下。

研究人员测试了大量具有遗传多样性的Cas蛋白,并从人类肠道细菌糖化镰刀菌中鉴定出明显的优胜者。

另一个障碍是能够进行DNA测序,该测序集中于少数获得新间隔物的CRISPR阵列,因为大多数阵列没有改变。

作者通过开发一种简单的方法来克服这个障碍,该方法选择性地隔离了新获取的间隔物的CRISPR阵列。

随着这些进展,J. Platt团队继续开发了一种称为Record-seq的方法来捕获基因表达谱。

他们对细菌大肠杆菌进行了基因工程处理,以含有来自糖酵菌的RNA捕获蛋白。

他们证实这些蛋白可以将间隔物结合到大肠杆菌细胞的遗传信息中,是RNA而不是DNA序列决定了相应的间隔物DNA。

在Record-seq中,RNA捕获蛋白在基因表达谱的记录期间表达。

在这段时间结束时,提取一个细胞群体的样本。新扩增的CRISPR阵列被分离和测序,并且间隔物与相应的基因组序列相匹配。

接下来的步骤是证明该方法可以如实地创建基因表达的记录,并确定在记录期间哪些关于细胞环境的东西可以被识别。

Record-seq可以在任何时候记录细胞中存在数百到数千种不同的RNA转录本。

尽管捕获的高度丰富的转录本存在大的偏差,但是通过RNA测序评估,特定RNA的转录本丰度通常与样本中获得相应间隔序列的频率相关。

此外,间隔物的收集可以根据培养细胞的生长条件形成特定的模式,允许作者使用这种间隔物“指纹”作为辨别细胞所经历环境的方法。

一个关键的结果是,J. Platt团队发现了,在生成间隔物的过程中,通过CRISPR采集器,支配选择RNA片段(通常平均约40碱基对)的特征。

J. Platt及其同事发现,这些片段富含腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸,通常来自RNA转录本的两端之一。

出乎意料的是,研究人员发现对特定序列侧翼用来生产RNA片段的RNA区域没有明显偏好。

这种侧翼序列,通常称为原间隔相邻基序(PAM),在识别过程中是必需的,它使CRISPR-Cas防御系统能够特异性地切割入侵者中预期的目标序列,但不能切割阵列中存在的相同序列。

因此,该系统可能产生一些间隔物,这些间隔物将不能启动有效的免疫应答,因为相应的目标序列没有被PAM侧翼。

这种可能性,以及RNA获取蛋白从细菌自身转录本获取RNA片段的能力,提出了这些系统是否、以及如何有效地保护细胞免受不想要的入侵者的问题。

在一个关键实验中,他们评估了每种技术捕捉细菌细胞对短暂接触有毒分子百草枯的转录反应的能力。

他们发现,只有Record-seq能够捕捉百草枯暴露转录反应的瞬时和剂量依赖性特征(图1b,c)。

J. Platt和他的同事们已经为使用Record-seq来监控复杂的基因表达谱奠定了基础,尽管有一些直接的技术限制必须克服。

目前的一个限制是间隔物获取仍然非常低效,需要至少1000万个细菌细胞如实地记录表达谱。

另一个原因是,他们只在细菌细胞中测试了他们的系统,而Record-seq的未来潜力很大可能来自动物和植物细胞。

最后,使用Record-seq对只有一个或两个间隔的阵列进行排序,原因与新扩展的阵列如何被分离和排序有关。

如果将该技术修改为分析更长的阵列,则可以提供一种识别同一记录周期中不止一个细胞活动的定时和强度的方法。

以DNA为基础的CRISPR技术在各种多细胞生物中的成功应用,以及Cas蛋白9-11工程的不断进展,为Record-seq可能克服这些挑战、并广泛使用提供了希望。


返回首页


参考文献

Transcriptional recording by CRISPR spacer acquisition from RNA

Florian Schmidt, Mariia Y. Cherepkova & Randall J. Platt





分享到:
会员登录
登录
我的资料
我的收藏
留言
回到顶部