CRISPR Cas9基因编辑技术( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是最新出现的一种由gRNA介导Cas9蛋白核酸酶特异靶向到靶位点，从而对目的基因进行编辑的技术。CRISPR是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击演化而来的获得性免疫防御机制。CRISPR基因编辑技术利用RNA与DNA杂交的原理，通过合成一个与特定DNA互补的gRNA，将CAS9蛋白靶向到靶位点，并进行切割产生DNA双链损伤。这种DNA双链断裂可以提高这个特定位点的重组效率，从而可以利用细胞的同源重组和非同源末端结合机制来进行基因组的编辑，如基因的敲入、敲除和定点突变。

crispr cas9基因编辑服务周期

1. gRNA载体设计和构建（1周）

2. gRNA和Cass9体外转录（1周）

3. mRNA显微注射受精卵（1月）

4. F0小鼠制作（2月）

5.　基因型鉴定（1周）

细胞质注射法获取F0转基因小鼠

细胞质注射法获取F0转基因小鼠.jpg

制备流程　　　　　　　　　　　　　　 Cas9的结构

CAS9结构.jpg

应用

•简化了流程，缩短了制作周期，降低了成本

•可以制作多个基因同时敲除的动物

•可以制作不同种属的基因敲除动物.如猪、牛、斑马鱼

几种常见哺乳动物基因编辑方法比较

	传统基因打靶	锌指核酸酶	TALEN	CRISPR
主要特征	利用细胞自身的重组机制将外源片段插入到靶位点	由锌指蛋白和Fok l核酸酶构成的融合蛋白，通过诱导DNA损伤，提高重组效率。	由TALEN repeat和Fok l核酸酶构成的融合蛋白，通过诱导DNA损伤，提高重组效率。	由gRNA和Cas9构成的RNA-蛋白复合体，通过诱导DNA损伤，提高重组效率。
优势	不需要诱导DNA损伤，无副作用，脱靶率低	高效，可以获得双敲除，可以用于人类细胞基因组的修饰，脱靶率低，不受物种限制。	高效，可以获得双敲除，可以用于人类细胞基因组的修饰，脱靶率低，不受物种、序列限制。	高效，可以同时敲除多个基因，可以用于人类细胞基因组的修饰，构建速度快、周期短、价格低、基因敲除效率比其他几个高，不受物种、序列限制。
劣势	周期长、成本高、很难获得双敲除、效率低、很难用于人类基因组的修饰	难于构建，周期长、成本高、无法识别任意目标序列，且识别序列常受到上下游序列影响。	较难构建，周期较长、成本较高。	不排除极低的脱靶率
应用	功能基因组学研究：特定基因的半敲除和完全敲除，利用标签追踪基因在不同发育时期、不同组织或器官中的表达和定位。疾病动物模型研究：进行药物筛查及个体化医疗、基因治疗（基因敲除、基因校正）动植物育种：发现基因修饰的新优良品种