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重金属的人工修复与天然微生物修复的比较作者：Elze Hesse , Daniel Padfield , Florian Bayer , Ele 广州美格生物在微生物研究领域有着丰富的经验。咨询热线：18027152056 重金属是指密度在5g-1 cm3以上的金属和类金属，它们在地壳中普遍存在。由于对矿产的需求激增，世界大部分地区目前都在开采矿藏，留下了大量未经处理的采矿废物。 此外，农业活动，如施用污水、污泥和磷肥，导致环境中重金属浓度增加。重金属通常在引入后会持续很长时间，并对人类、植物和野生动物产生不利影响。 因此，人们有必要修复金属污染的环境。酸性环境在矿山退化场地中普遍存在，在这种条件下，许多重金属的生物利用度通常会增加。 含石灰的材料通常用于治理严重金属污染的土壤，以中和土壤的pH值，固定重金属，从而促进自然再生。 生活在受污染土壤中的微生物群落进化出各种抵抗机制，包括隔离、流出和细胞外螯合。其中有些机制，特别是螯合作用，也可以改善环境。 许多这种螯合作用都是由含铁细胞Siderophore--低分子量、高亲和力的铁螯合剂进行的，这些螯合剂产物是许多微生物因为应对铁缺乏而产生和分泌的。 虽然铁细胞的典型功能是清除铁，但这些化合物也与其他金属结合，从而阻止它们被吸收到细胞中，并使环境毒性降低。 我们最近的研究表明，产生铁细胞的微生物类群在金属污染土壤中有选择性地受到“青睐”。 针对有毒金属，铁细胞提供了物种内部和跨物种的有利保护。 因此，提高pH值可能会对这种天然净化过程产生不利影响，从而降低整个社区的铁细胞的平均含量。然而，铁，限制生长的一个主要因素，在基本环境中变得越来越不容易溶解（ph>6.5）。 因此，石灰处理可能选择性地有利于因为缺铁而产生铁细胞的微生物类群。 但是，石灰处理对铁细胞生产（以及相关的自然净化）的净效应尚不清楚。 我们通过实验确定了对酸性矿山退化土壤进行石灰化处理对微生物群落功能（即金属螯合铁细胞的产物）和组成的影响。 我们在一个旧采矿区收集了30个不同的土壤样本，以确定石灰对土壤的初始酸碱度、金属含量和群落组成的影响是否一致。 我们采用配对设计，将每一种土壤置于两种不同的选择条件下，在有或无熟石灰的情况下，将土壤微观结构培养12周。 在试验处理前后，对土壤特性和产铁量进行了定量分析。此外，我们通过对16S rRNA基因（包括芽孢杆菌等孢子形成细菌）的测序来测量群落组成的变化。 我们的研究结果表明，石灰处理法阻碍了特定微生物群落天然去污特性， 产生少量或甚至没有铁细胞，从而导致群落铁细胞产量的净减少。 2. 材料和方法 （a）研究地点和土壤取样 我们在英国康沃尔郡Poldice山谷的废弃多金属矿区，沿自然金属梯度，采集了30个土壤样本。之后当天对土壤酸度进行量化。 每个样本的一小部分土壤在-80°C下储存，用于表型分析和DNA提取；剩余部分用于建立选择实验。 （b）选择实验 为了检验石灰处理对自然微生物群落铁细胞产物的影响，我们建立了实验微环境，将每个样本30g的土壤放在两个一样的90mm培养皿中。 我们采用配对设计，实施了两种不同的选择方案：将单剂量的熟石灰（将100毫克Verve Garden石灰溶于5毫升无菌二次蒸馏水中）添加到成对微观结构中的一半，将5毫升无菌二次蒸馏水ddH2O 中添加到其余部分中。在26°C和75%相对湿度的室内环境中，对石灰处理的和对照的微环境（n=60）进行培养，整个过程中保持湿润。 培育12周后，我们收集样本，进行以下操作 （i）量化土壤酸度和重金属浓度， （ii）表征微生物群落， （iii）准备冷冻库进行铁细胞鉴定分析。 用6ml M9缓冲液和无菌玻璃珠，将1g土壤旋转离心处理1分钟，然后将土壤洗液储存在-80°C、最终浓度25%的甘油中。 （c）土壤特性 将1g土壤放到5ml/ 0.01M氯化钙CaCl2中，然后摇动30分钟，静置1小时，定量确定实验操作前、后，土壤酸度，之后测量pH值。 对于实验土壤，我们还使用前面描述的分离程序，定量测定可溶性金属浓度。简单地说，我们将每个微环境5g的土壤放入装有5ml二次蒸馏水的50ml试管中，轻轻摇晃以分散土壤团聚体，并以300 r.p.m.的速度离心1分钟，以去除固体。将1ml上清液转移到Eppendorf 管中，并以3000 r.p.m.的速度重新旋转3分钟以去除最终固体。 产生的上清液按1:1稀释在1%的HCl中，然后用ICP-MS测定溶液化学成分（Ag、Al、As、Cd、Co、Cu、Cr、Fe、Ga、Mg、Mn、Ni、Pb、Sn、Ti和Zn）。 由于绝大多数土壤微生物都存在于孔隙网络的间隙空间内，因此孔隙水中可溶性金属的存在是金属有效性和毒性的一个很好的代表。 （d）微生物群落特征 为了确定不同土壤中的群落组成是如何变化的，我们使用Mobio Powerlyzer Powersoil DNA分离试剂盒，从250mg/样本土壤（全部储存在-80°C的缓冲液和C1溶液中）中提取了基因组DNA，按照设备的协议，将bead beating参数设置为4500 r.p.m.，运行45秒。 按照设备的协议，使用Zymo OneStep PCR Inhibitor Removal Kit试剂盒对样品进一步清洁。用1%TAE琼脂糖凝胶和1xRedsafe DNA染料（20000×）证实了DNA的完整性，共产生78个高质量DNA样本（即排除了2、8、11和15个样品，因为DNA产量不足以进行扩增子测序）。 使用Illumina MiSeq 16S Ribosomal RNA基因扩增子工作流程对16S rRNA基因v4区的扩增子进行测序，使用以下引物： Forward: 5'ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGTGCCAGCMGCCGCGGTAA3′ Reverse: 5'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAAT3′. 我们使用FastTree估算了系统发育树，该树使用相似**似然法，从核苷酸序列比对中估计系统发育。然后，在进行分析之前，我们进一步进行质量控制，处理序列数据。 （e）铁细胞分析 对于每种独特的土壤处理组合（n=90），我们将连续稀释的冷藏物放在LB琼脂板上，添加最终浓度为20μg ml-1的制霉菌素，以抑制真菌的生长， 量化铁细胞产物。 将这些板在28°C下培养48小时，然后随机从每个样品选择24个单独的分离株，并在2ml铁限制性CAA介质中培养， 该介质含5g酪蛋白氨基酸、1.18g K2HPO4.3H2O、0.25g MgSO4.7H2O L-1、补充20mM NaHCO3和100μg ml-1人脱铁运铁蛋白。 在28°C下生长48小时后，我们在3000 r.p.m.的速度将培养物离心15分钟，并使用Schwyn和Neilands所述的液体CAS分析来分析上清液，以确定铁螯合的程度，修改后将一体积的二次蒸馏水添加到CAS分析溶液中。 使用公式 [1-（Ai/Aref）]/（ODi）估计每个分离物的铁细胞产量，其中光密度ODi=600nm，混合物（上清液+CAS溶液）吸光度Ai=630nm, 参考未培养混合物（CAA+CAS溶液）的吸光度Aref=630nm。我们测量了常见园林条件下的铁细胞产量，以避免现场环境变化的混淆效应。 （f）统计分析 石灰处理对土壤酸度和重金属含量（有色金属和总可溶性金属）的影响采用线性混合效应模型（“lmer”函数来自“lme4”包）进行测试，对单个样本（n=30）进行随机截取，以说明土壤的特定依赖性。 我们使用类似的方法来测试石灰处理对铁细胞生产的影响。一般来说，通过顺序逐步删除非显著因素后（p>0.05），简化了完整模型，然后利用似然比检验，建立解释变量的显著性，形态是χ2分布。 在处理效果显著的情况下，使用R包“multcmp”中的“glht”函数计算Tukey对比度，α<0.05。可溶性金属的浓度变化很大，从0到1042 mg l-1的孔隙水（图2）。 为了测试石灰化对稀有金属的应用价值的影响，我们特别通过将样品的特定金属量除以每种金属的总平均值，来计算成对样品之间的标准差。 然后，我们使用单尾t检验将标准化治理差异与零进行比较，并对多次检测进行校正（“p.adjust”，方法=“fdr”）。 我们从这些分析中去除了一些金属（砷、镓、铅、锡和钛），因为大多数样品含有不可检测水平。 3. 实验结果 （a）石灰化降低土壤酸度和总非铁金属可用性。 横跨金属梯度的土壤的pH值变化很大，在实验操作之前主要是酸性的（图1a）。 石灰处理对提高土壤的PH值有理想的效果（χ22=64.85，p<0.001；图1b）。
（a）土壤主要为酸性（T0，黑色符号），远远低于pH中性的蓝色阴影区域。符号大小表示石灰（L，红色符号）和对照（C，浅蓝色符号）处理改变初始土壤酸度（T0）的程度。 注意，石灰添加对酸性更强的土壤的影响更大。 （b）盒状晶须图，显示土壤PH因石灰化而降低。方框描述了特定处理的原始数据的上四分位数和下四分位数，中心线显示了中间值和胡须，提供了1.5×四分位数范围的测量值。 字母表示显著的Tukey对比，α<0.05。 铁是所有样品中最常见的金属，石灰化并没有限制其可用性。 因此，两种处理之间的总的铁金属可用性无差异（χ21=0.96，p=0.33；图2b）。然而，在石灰处理的土壤中，有色金属的总有效性显著降低（χ21=3.96，p=0.047；图2c）。 由于不同的金属溶解度和共沉淀的可能结果，不同金属的石灰化效果差异很大。 值得注意的是，虽然没有一种量化金属在石灰处理的土壤中更容易获得，但石灰处理确实显著降低了可溶铜Cu和铝AI的水平，这两种金属在高浓度下都可能有毒。 石灰化降低了非铁金属子集的可用性。
图2 （b）石灰化改变微生物群落组成 样本间群落组成的大部分变化由自然金属梯度解释。虽然这些群体间的巨大差异在一定程度上掩盖了石灰化的影响， 但一些常见的门的相对丰度，包括嗜酸菌、氯氟菌和双子体，在石灰化反应中发生了变化。一致地，我们的分析证实不同的处理方法有利于不同的分类群：当分解成多个成对比较时，石灰处理和对照组、石灰处理和祖先群落的群落组成显著不同。 （c）石灰选择抑制脱毒铁细胞 微生物群落在铁细胞产物上自然发生变化，所有祖先群落都含有多个铁细胞生产分离株。至关重要的是，石灰处理对铁细胞的产生有很强的抑制作用。 与祖先组或对照组相比，经石灰处理的样本的平均铁细胞产物显著降低。 4. 讨论 我们的研究结果表明，尽管微生物可以产生多种具有不同金属亲缘关系的铁细胞，祖先群落的初始组成和pH值差异很大，但石灰处理始对一系列铁细胞生产的类群有抑制。我们的研究结果表明：影响的主要原因是石灰处理降低了有毒金属的可用性，对铁细胞介导的解毒作用几乎没有帮助。 因此，缓解金属毒性影响的干预措施很可能对其他修复环境的微生物抗性特征（例如，金属固存）进行选择，而不管这些特征是否主要有益于参与者或向其他社区成员提供合作抗性。 我们以前的研究表明，在整个群落范围内，铁细胞的生产变化主要是由物种分类决定的。 虽然石灰对群落组成有显著影响，但与历史环境条件影响的结果相比，石灰对群落的影响相对较小，石灰经常选择群落间不同类群。 这意味着石灰的加入只是选择产生高铁细胞的微生物类群，因为当不需要修复时，铁细胞生产的边际成本变得更高。 我们目前和以前的研究结果表明，土壤微生物群落中的种群周转率很高，而且随着时间的推移，含铁细胞的产物会迅速变化，这可能并不令人惊讶，因为这主要是由物种分类驱动的。 因此，停止添加石灰可能会导致微生物铁细胞产物的恢复。这就提出了一个问题，即是否存在与中长期化学修复相关的任何负面后果。 虽然石灰处理降低了土壤酸度和金属溶解性，但实际上并不能从环境中去除有毒金属。 另一方面，当结合使用超富集植物（植物萃取）时，铁细胞或产生铁细胞的微生物可以帮助去除重金属。 具体来说，如果金属与微生物铁细胞结合，这些植物对金属的吸收通常会增强。虽然在农业环境中，对含金属土壤进行石灰处理可以增加植物产量，但它确实会减少植物对金属的吸收，相关和实验研究表明，PH大于7的土壤与PH小于7土壤相比，PH大于7土壤，微量金属的积累量较低。 这种ph值调节的金属吸收是否是由铁细胞生产的变化引起的？这需要通过实验加以解决。 石灰介导的针对脱毒铁细胞的选择可能会抵消生物量积累增加带来的好处，从而阻碍植物提取修复效果。 我们的研究结果表明，石灰化，一种常见的干预实践，阻碍自然微生物解毒的选择。微生物促进了许多调节生态系统服务的过程，包括分解和矿化、疾病起因和抑制以及污染物去除。 了解人类干预对微生物特性（如解毒、抗性）的生态进化后果是进化弹性微生物群落工程的关键，对植物修复具有重要意义。 参考文献 Anthropogenic remediation of heavy metals selects against natural microbial remediation，royalsociety Elze Hesse , Daniel Padfield , Florian Bayer , Eleanor M. van Veen , Christopher G. Bryan and Angus ， 相关阅读 |
