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Nanopore测序技术介绍

Oxford Nanopore Technologies 公司在 2012 年基因组生物学技术进展年会(AG BT)上发布了掌上型测序仪 MinION 及测序平台 GridION,引起行业轰动,Oxford Nanopore 平台不断升级,相继推出通量更高的 PromethION 及更小更便携 SmidgION 平台,相关科研论文也陆续发表,未来也将对数据错误率及平行测序的通量问题不断突破,为行业带来新的测序时代。

NANOPORE.png

一、测序原理

Nanopore是一种单分子,实时测序的新一代测序方法,其以单分子DNARNA)通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。具体测序原理如下图所示:

NANOPORE2.png

1 Nanopore 测序原理

1.        解螺旋,将双链DNA解开成单链。

2.        DNA单链分子通过一个孔道蛋白,孔道中有个充当转换器的蛋白分子。

3.        DNA单分子停留在孔道中,有一些离子通过带来电流变化,而不同的碱基带来的电流变化是不同的。

4.        转化器蛋白分子感受5个碱基的电流变化。

5.        根据电流变化的频谱,应用模式识别算法得到碱基序列。

二、测序读长

因为测序原理无需要DNA聚合酶的链式反应,所以不存在DNA聚合酶的失活问题,理论上只要DNA分子不断开,就一直可以通过纳米孔,目前在对于人和大肠杆菌的测序种观测到的read1Mb

表格1:三种不同建库方法Nanopore测序情况

DNA建库方法

序列数

平均读长

Read N50

Ligation Library

451020

8,012

13,920

Rapid Kit Library

315684

13,796

30,397

Ultralong reads   Protocol

694659

24,179

99,790

Ligation建库方法测序读长的readN50达到14k左右,超长建库方法read N50达到 100k。

三、测序准确率

Nanopore测序准确率和Pacbio持平,为86%左右。

测序read的平均准确率为90%(如图二所示),如果选择1D2测序方式,即对于DNA的正负链都进行测序,可以达到96%的准确率。详细的情况见图2

NANOPORE3.png

2   ANanopore 对于DNA进行1D和1D2 测序的read平均质量值B: Nanopore测序错误率分布。

四、优势

基于 Oxford Nanopore 测序技术,对动植物基因组进行测序及拼接组装(纯三代组装),较好地解决了传统测序组装技术中高杂合度、高度重复区域、异常 GC 含量区域等诸多组装难题,极大提升了大基因组的组装指标,重新定义了 ContigN50、Scaffold N50 指标——采用纯三代组装的基因组组装指标,是过去二代测序策略的 10-20 倍以上。 这不但令许多复杂基因组物种能够获得更精确的基因组参考序列,也为近缘物种的基因组差异分析提供了更好的解决方案:

•单个物种的基因组组装与研究(特别是高杂合度、高重复性、多倍体等复杂基因组)

•同种不同亚种或同属不同种的基因组组装与比较基因组分析




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