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用CRISPR技术检测粪便样本中的幽门螺杆菌作者：Magigen 1.1 幽门螺杆菌（H.pylori）是一种螺旋状、革兰氏阴性、微嗜气性细菌，与多种胃十二指肠疾病有关，如慢性胃炎、消化性溃疡、胃粘膜相关淋巴组织（MALT）和胃腺癌。 据估计，全球50%以上的人口感染了幽门螺杆菌，幽门螺杆菌的流行可能与社会经济状况相关，发展中国家的情况可能更糟。 众所周知，幽门螺杆菌感染可以通过侵入性和非侵入性方法进行诊断。非侵入性方法，如尿素呼气试验和血清学试验，在临床实践中得到广泛应用。 非侵入性方法检测幽门螺杆菌的局限性 几乎所有常用的非侵入性方法都有局限性。口腔环境中的幽门螺杆菌可干扰尿素呼吸试验；此外，儿童体内二氧化碳生成不足也限制了该测试的应用。幽门螺杆菌抗体即使在根除后也可能在循环系统中长期存在，这可能导致假阳性结果，导致不必要的治疗。一些实验室利用PCR检测粪便样本中的幽门螺杆菌核酸，但要获得保存完好的粪便样本和完整的核酸比较困难。此外，样品中的某些物质可能会抑制PCR检测。更重要的是，这些非侵入性方法都不能广泛应用于流行病学研究，尤其是大规模筛查感染患者。 因此，护理点检测迫切需要一种快速、准确、简单和便携的新技术。基于金纳米颗粒（AUNP）或其他纳米颗粒的横向侧流生物传感器LFB，是护理点检测的合适报告设备。在有分析物存在的情况下，纳米颗粒聚集时会发生比色变化，无需使用复杂的仪器即可通过肉眼观察信号结果。 虽然有关于使用LFB进行核酸检测的报告，但LFB最有可能用于当前体外诊断IVD产品中的抗原或抗体检测。 为了实现这一目标，我们建立了一种基于CRISPR-Cas12a技术的检测粪便标本中幽门螺杆菌的新IVD检测方法。 CRISPR Cas技术 CRISPR Cas免疫系统已广泛应用于分子生物学研究领域。Cas免疫系统瞄准并切割可用于基因组编辑的特定核酸序列。 在本研究中，我们建立了一种基于CRISPR-Cas12a技术、检测粪便标本中幽门螺杆菌的新工具，并对这种新检测方法的性能进行了评估。 方法和材料 2.1 患者人口统计信息和临床标本收集 在研究期间，纳入了41名到珠江医院进行内镜检查的胃症状患者。该研究由南方医科大学珠江医院的机构审查委员会IRB批准，该研究符合赫尔辛基宣言。 所有参与本研究的患者均获得知情同意。表1列出了患者人口统计信息。 在内窥镜手术之前，从每位患者身上收集正常排空产生的粪便样本约5g。粪便样本放在含有3毫升RNALETER（Ambion，AM7020，Thermo Fisher Scientific）的烧瓶中，并储存在–80℃深度冷冻柜中，直至分析。 2.2 DNA提取 临床样本采集，使用TIANamp粪便DNA试剂盒。按照说明提取DNA，200µl用于提取，DNA在50µl中洗脱。 2.3 重组酶聚合酶恒温扩增 使用NCBI引物扩增设计，采用重组酶聚合酶恒温扩增RPA引物，扩增子大小在100到140 bp之间，引物熔化温度在54°C到67°C之间，引物大小在30到35nt之间。 RPA中使用的引物为正向引物5′-GaAATTATTGTTTA GTGGCTTTATCG-3′和反向引物5′-GGATNGGCTTTCAA GTGGGCTAARCAAT-3′。 按照TwistAmp Basic（TwistDx）的说明进行RPA反应。 冻干RPA 将小球重新悬浮在29.5μl的复水缓冲液中，然后添加引物和2μl未测量浓度的目标DNA模板。为了进行比较，在qPCR检测中使用另外2μl目标DNA模板。然后用dH2O将体积增加到47.5μl，然后添加2.5μl 280mM醋酸镁（MgOAc），以产生含有0.48μM正向和反向引物与14mM MgOAc的50μl混合物。短暂混合后，将混合物在优化温度37°C下培养30分钟。使用琼脂糖凝胶电泳观察RPA产物。 2.4 CRISPR Cas12a反应 RPA反应后，向CRISPR-Cas12a反应系统中添加1μl RPA产物，该反应系统为50μl混合物，含有10mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、50 mM NaCl、1 mM DTT、20nM Magigen CRISPR Cas12a和1ng/μl向导RNA（gRNA）。对于荧光、CRISPR-HP分析和LFB-CRISPR-HP分析，分别包括10 nM荧光探针（FAM-5′-AAAAA-3′-Dabcyl）和20 nM LFB探针（地高辛-5′-AAAAA-3′-生物素）。对于荧光CRISPR HP分析，反应在37°C下培养20分钟，并使用SLAN-96S实时PCR系统进行实时或终点荧光检测。对于LFB-CRISPR-HP分析，在37°C下培养20分钟后，将反应混合物装载到LFB上。 2.5 横向侧流生物传感器检测 横向侧流层析试纸条制作方法 为了制备AuNP-抗地高辛抗体结合物，将10μg单克隆抗地高辛抗体和8μl 0.1 M K2CO3添加到1 ml AuNP溶液中，并在室温下轻轻摇动混合物1 h。然后，将100微升10%BSA添加到抗地高辛抗体包被的AuNPs中。将溶液在室温下培养1小时，然后离心（9.425×103 g，20分钟），并用冲洗缓冲液（20 mM Na3PO4，5%BSA，0.25%吐温-20，10%蔗糖和0.1%NaN3）冲洗三次，以去除任何未结合的抗地高辛单克隆抗体。将红色颗粒重新悬浮在300μl的冲洗缓冲液中，然后在4°C的冰箱中储存，直至使用。 对于LFB构建，30μl 1g/ml链霉亲和素（SA）和30μl 2mg/ml山羊抗鼠抗体通过侧向流动分配器同时分配到硝化纤维素膜（25mm×30cm，毛细速率：140±40s，厚度：145±20μm）上，形成试验区和对照区。然后将膜在室温下干燥12小时，并在4°C下储存，直至使用。在样品垫缓冲液（1%Triton，1%BSA，2%葡萄糖，50 mm硼酸，pH 8.0）中浸泡后，使用玻璃纤维条（27 mm宽）作为样品垫。将样品垫干燥并在室温下储存在低湿度抽屉中。以1μl/cm的速度将AuNP-抗地高辛抗体结合物喷洒在样品垫上。 吸水垫是17毫米宽的厚吸水纸条。将一条样品垫、硝化纤维素膜和吸收性垫沿粘附板的长轴连接，重叠2–3mm。然后用切纸机切成0.22厘米宽的条状。在使用前，这些条在室温下储存在低湿度抽屉中。对于LFB检测，将所有50μl CRISPR-Cas12a反应产物装载到样品垫上，10分钟后记录结果。 2.6 CRISPR-HP检测的灵敏度 为了确定CRISPR-HP分析的检测限，连续稀释幽门螺杆菌（ATCC 43504），并使用TIANamp Micro DNA试剂盒提取基因组DNA。通过荧光CRISPR-HP分析和LFB-CRISPR-HP分析对提取物进行检测。 2.7 CRISPR-HP检测的特异性 使用粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠沙门氏菌、福氏志贺菌、副溶血性弧菌进行特异性测定。 使用DNA试剂盒提取基因组DNA。通过荧光CRISPR-HP试验和LFB-CRISPR-HP试验检测提取物。 3. 结果 3.1 RPA和CRISPR-HP系统的建立 根据幽门螺杆菌的基因组序列，设计并筛选了5套RPA引物和相应的CRISPR gRNAs。候选引物的保守性通过六株幽门螺杆菌的序列比对进行评估。使用TwistAmp碱性试剂盒，从幽门螺杆菌ATCC 43504中提取基因组DNA，评估五套引物的性能。在37℃下进行30分钟的扩增。在琼脂糖凝胶中分离RPA产物并在紫外光下观察。 如图1A所示，在五组引物中，F4/R4组产生的预期大小的产物最多，而阴性对照中未观察到非特异性产物。因此，选择引物组F4/R4并将其用于以下RPA分析。 还通过荧光信号检测评估了为Magigen CRISPR-Cas12a系统优化的gRNA。为了进行荧光检测，向CRISPR-Cas12a系统中添加1μl RPA产物，并将反应系统在37°C下培养20分钟（20个周期，每个周期1分钟）。结果表明，gRNA1产生的荧光信号最多。因此，选择gRNA1并将其应用于CRISPR-Cas12a系统（图1B）。 3.2 LFB-CRISPR-HP分析 尽管荧光CRISPR HP检测法是检测幽门螺杆菌的一种简单方法，但仍然需要荧光激发源和荧光阅读器。为了使分析更简单、更可行，例如，不依赖复杂的仪器，我们采用了LFB方法，其结果可以通过肉眼读取。幽门螺杆菌的靶序列首先通过RPA扩增，然后提供给CRISPR-HP系统。 靶序列的存在激活了Cas12a，导致探针降解。CRISPR系统在荧光CRISPR HP分析和LFB-CRISPR-HP分析中类似，但所用探针除外。在LFB-CRISPR-HP分析中，使用地高辛和生物素双标记探针。最后，将CRISPR-HP系统的产品加载到LFB上。LFB含有在样品垫上用金纳米粒子标记的抗地高辛抗体和在硝化纤维素膜上的两条线。 SA和山羊抗鼠抗体分别结合在**和第二条线上。在没有目标DNA的情况下，探针保持完整，**行通过AuNP探针SA链接捕获AuNP；因此，在**行出现了一条红线。第二条线也可以捕捉到剩余的AUNP，在第二条线可以观察到一条红线。当靶DNA存在时，探针被Cas12a非特异性切割降解，**条线不能捕获AuNPs；相反，他们被第二条线俘虏；因此，只有第二行出现了一条红线。 反应混合物（不使用荧光探针，而是使用生物素地高辛探针）也在37°C下培养20分钟进行LFB测试，并将板条的样品垫插入反应溶液中10分钟。LFB结果与荧光检测结果完全一致。 3.3 CRISPR-HP的敏感性和特异性 检测分析 在建立荧光CRISPR-HP检测方法和LFB-CRISPR-HP检测方法后，评估CRISPR-HP检测方法的敏感性和特异性。幽门螺杆菌的基因组核酸被连续稀释，CRISPR-HP能够检测到的最低浓度被认为是检测极限LoD。将其置于37℃恒温槽中30分钟。 然后，将1μl RPA产物添加到CRISPR-Cas12a反应系统中，并将混合物置于37℃恒温槽中20分钟。将无菌水设置为非模板对照（NTC）。CRISPR-HP检测的产物通过荧光CRISPR-HP检测和LFB CRISPR-HP检测进行检测。尽管1拷贝/μl的终点荧光强度不如幽门螺杆菌DNA浓度较高时的荧光强度高，但其显著高于NTC。 荧光CRISPR-HP检测限为1拷贝/μl。对于LFB-CRISPR-HP检测，当检测浓度高于5拷贝/μl的幽门螺杆菌DNA时，出现了检测线。因此，LFB-CRISPR-HP分析的LoD为5份/μl。 然后，还评估了CRISPR-HP检测的特异性。 几种常见的肠道病原体，如粪肠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠道葡萄球菌、福氏葡萄球菌、宋氏志贺氏菌和副溶血性弧菌，用于评估CRISPR-HP分析。所有病原体（包括幽门螺杆菌）的基因组DNA均按照上述程序提取。我们在37°C恒温浴中建立RPA系统20分钟。通过荧光CRISPR HP分析和LFB-CRISPR-HP分析对产物进行测试。 3.4 RPA系统可有效扩增幽门螺杆菌 粪便样本中的幽门螺旋菌DNA 在建立CRISPR-HP检测方法并评估检测性能后，新的检测方法被应用于检测临床粪便标本中的幽门螺杆菌DNA。收集41例经快速尿素酶试验或尿素呼气试验确诊的患者粪便标本。由于两种方法的采样点与粪便不同，诊断结果可能无法真实反映粪便标本中是否存在幽门螺杆菌DNA。因此，我们建立了检测粪便标本中幽门螺杆菌DNA的qPCR方法作为金标准。从粪便样本中提取总DNA，并通过qPCR和CRISPR-HP检测。临床诊断和qPCR的比较如表3所示。根据qPCR结果，**批临床阳性的三个样本为阴性。 在qPCR、荧光CRISPR-HP分析和LFB-CRISPR-HP分析中，41个样本的所有结果都是一致的，表明荧光CRISPR-HP分析和LFB-CRISPR-HP分析在临床粪便样本分析中的**性能。
图1 RPA和CRISPR-HP系统的建立。 （A） 所有引物组的琼脂糖凝胶电泳结果。将所有引物组（F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4）分别加入含有或不含有幽门螺杆菌DNA的RPA反应中，并对RPA反应产物进行电泳分析。 （B） 用于CRISPR-HP分析的两种gRNA的实时荧光信号；红色，gRNA 1；蓝色，grna2；灰色，没有gRNA 参考文献 CRISPR-based detection of Helicobacter pylori in stool samples 作者 Enming Qiu1, Shaoqin Jin2, Zhuo Xiao3, Qianyun Chen1, Qiaohui Wang4, Huayong Liu3, Chanfang Xie3, Chong Chen3, Zhou Li1, Shuai Han1 1. General Surgery Center, Department of Gastrointestinal Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China 2. Department of Gastroenterology, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China 3. Guangzhou Pluslife Technology Co, Ltd, Guangzhou, China 4. The Second School of Clinical Medicine, Southern Medical University, Guangzhou, China Correspondence Zhou Li and Shuai Han, General Surgery Center, Department of Gastrointestinal Surgery, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, No. 253. Gongye Middle Avenue, Haizhu District, Guangzhou, Guangdong 510280, China. Emails: gzlizhou@smu.edu.cn; gzhanbo0624@smu.edu.cn Chong Chen, Guangzhou Pluslife Technology Co., Ltd., Room 406, A01,No. 78. Luntou Road, Haizhu District, Guangzhou, China. Email: noah.chen@pluslife.com 相关阅读
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