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布罗德研究所利用CRISPR技术检测新冠病毒变种、呼吸道病毒

作者:Magigen

布罗德研究所和其他组织的研究人员合作,开发了一种高通量、多路复用的CRISPR技术组合,用于检测COVID-19新冠病毒和新出现的新冠病毒变种,以及其他呼吸道病毒,目的是解决核酸检测和下一代测序平台的一些局限性。

合作者最近在《自然医学》杂志上发表了他们的临床评估结果,描述了该组合在检测SARS-CoV-2、其他冠状病毒、甲型流感和乙型流感,以及识别和区分六个SARS-CoV-2变异谱系方面的开发和应用。这6个新冠病毒变种分别是 α、β、γ、δ、ε和奥米克戎。

布罗德研究所检测开发者和《自然医学》论文第一作者韦尔奇说,该组织的总体目标是帮助缩小临床诊断和测序之间的巨大差距。

该新平台被名为微流控组合阵列反应mCARMEN,Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids,用于核酸的多重评估,将CRISPR技术与微流控技术相结合。mCARMEN是目前唯一 一种将监控功能整合到单一技术平台的诊断工具,它能够在一天内检测数百个样本,以检测多种呼吸道病毒和变种,同时还能量化病毒基因组拷贝。

该平台的周转时间为4至5小时,可与基于RT-PCR的COVIID-19诊断检测相媲美,比用于变异监测的测序技术更快、更便宜。mCARMEN在不到一天的时间内检测和识别变异,每个样本13美元,大约是基于测序的变异识别成本的十分之一,这可能需要7到14天才能提供结果,对SARS-CoV-2诊断测试来说太慢,对变异监测来说并不理想。

该平台的诊断组合可以检测到21种呼吸道病毒,有可能对出现难以解释和区分的呼吸道症状的患者进行全面检测。

根据《自然医学》的报告,mCARMEN的呼吸组合中对525例患者标本和马萨诸塞州总医院的166例标本进行了诊断等级的测试。

它还在2088份患者标本中鉴定出6个SARS-CoV-2变异谱系,并且在该组合中添加Cas13蛋白和Cas12蛋白酶,能够定量测量样本中的新冠病毒和甲型流感病毒副本。

在FluidGM Biomark X微流控系统上使用集成流体电路,并部署机器学习来设计高活性CRISPR RNA分子,该方法的关键。

对于CRISPR检测,CAS核酸酶结合,并使用高度活跃的CRISPR RNA分子作为靶向特定相关序列的向导。当CAS核酸酶与靶序列结合时,它会切割附近的荧光报告物,从而释放出指示病毒序列存在的光信号。

在2018年开发的第一个概念验证原型CARMEN中,研究小组利用Cas13核酸酶在单个阵列上测试了4500多个crRNA靶对。在成对液滴组合用于荧光显微镜检测之前,分离并限制Cas13-crRNA复合物,进行条形码和乳化。这种方法在八个样本中同时检测到169种病毒,但吞吐量低,需要定制成像芯片和读取硬件设备。

迈赫沃德是《自然医学》论文的资深作者,帮助布罗德研究所开发了概念验证平台。

迈赫沃德说:“当新冠病毒来袭时,我们决定通过添加关键病毒来改造这个组合,并寻求开发一种可广泛使用的技术版本。”

目前,该平台可以在其他实验室建造和使用,但这个过程只需要花费大量时间和精力。

该平台可以自动化某些步骤。FluidGM平台的加入使其他手动过程实现了自动化,例如制备和混合单个乳液,以便为显微镜成像做好准备。

《自然医学》研究表明,结合mCARMEN平台的力量,利用最新的CRISPR技术和FLUIDIGM微流体,添加Biomark X实时PCR平台,可以在全球范围内轻松部署,用于传染病监测。

mCARMEN现在由自动化RNA提取、热循环扩增、微流控芯片和大型台式阅读器组成, 是一个与大型实验室RT-PCR检测系统大小相似的平台。

使用Biomark X,mCARMEN可以使用96种不同的检测方法检测96个样本的独特组合,或者检测192个样本中多达24种不同的病毒或变种。微流控仪器还可以优化呼吸样品组合,使其易于使用,并将得出结果的时间缩短到5小时以下,而原始平台的时间为8到10小时。

在《自然医学》的研究中,该小组比较了mCARMEN与其概念验证原型在检测代表21种病毒靶标的合成DNA片段方面的表现。两个版本的分析特异性均为100%,但mCARMEN对102个拷贝/μL的敏感性为100%,对101个拷贝/μL的敏感性为98.4%,而早期版本的敏感性分别为86%和77.8%。

此外,与分子诊断分析的结果相比,在Mass General对存档的临床和人工标本进行测试时,呼吸病毒组合对所有病毒靶点的预测值均为100%,对人类偏肺病毒的预测值均大于95%(人类偏肺病毒除外)。

虽然其他临床研究人员在Mass General验证了该平台,但韦尔奇开始将其用于检测SARS-CoV-2变异,并开发了一个与呼吸系统集成的组合,并且在出现新变异时,不需要对检测进行大规模重新设计。

新冠病毒变异组合通过检测广泛的单核苷酸多态性来捕获独特的突变模式或指纹,因此,mCARMEN可以根据特定指纹的普遍性快速标记样本,使测序能够确定变异谱系。

Omicron变种出现后不久,哈佛大学的CLIA认证检测实验室和马萨诸塞州公共卫生部开始向韦尔奇发送样本,韦尔奇使用mCARMEN检测该变种。

韦尔奇说:“很多合作者和第三方联系人都有兴趣使用mCARMEN检测呼吸道病毒、新出现的变种,或者在未来检测血液传播的病原体。”他指出,罗德岛卫生部、美国疾病控制中心、,美国国防部(DoD)国防高级研究计划局(DARPA)和非洲基因组学和传染病卓越中心(ACEGID)是合作者之一。

在努力征服COVID-19冠状病毒疾病的过程中,少数其他开发者转向CRISPR技术来检测SARS COV-2病毒,包括圣地亚哥加利福尼亚大学,以及剑桥,马萨诸塞州州的Sherlock 生化公司,其Sherlock CRISPR SARS-CoV-2试剂盒已获得美国食品和药物管理局的紧急使用授权,该试剂盒专为大批量CLIA实验室和医院设计。

2020年,布罗德研究所的研究人员还向FDA申请了呼吸专家组的EUA测试,作为实验室开发的测试,但FDA表示,当时它在一个实验室进行了非优先测试,没有审查申请。

该组织将继续留意FDA的优先事项,并可能决定申请一项新的授权,其中包括新冠病毒变体组合。


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