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利用CRISPR技术直接快速检测新冠病毒RNA作者：Magigen 来自美国蒙大拿州立大学的研究人员开发了一种基于CRISPR的诊断技术，用于检测COVID-19新冠病毒的核糖核酸（RNA）。 尽管定量聚合酶链反应qPCR检测非常可靠，是检测核酸的金标准，但它需要训练有素的人员、精密的设备、高效的样本处理和较长的周转时间。 由于冠状病毒COVID-19大流行的原因，我们迫切需要开发易于分发、易于执行和快速的诊断方法。目前，人们可以通过快速抗原检测和等温扩增方法来解决，但它们的敏感性、特异性或多功能性存在一些局限性。CRISPR RNA引导的诊断方法是可以解决当前局限性的新兴技术。 蒙大拿州立大学研究人员开发了一种基于CRISPR的诊断方法，用于从各种样本中聚合和获取SARS-CoV-2 RNA的特异性序列。 III型CRISPR RNA引导复合物，如Cmr和Csm，结合并切割互补单链（ss）RNA。将来自嗜热热菌（TtCsmCsm3-D34A）的突变体（D34A）、核糖核酸酶（RNase）-dead, III型-A CRISPR复合物（Csm3）与放射性标记（32P或32P）靶向RNA和非靶向RNA混合培养，以提高灵敏度，并测试其是否能聚集序列特异性RNA。 研究人员观察到，大多数（76±5.8%）32P标记的靶向RNA被复合物捕获，而非靶向RNA集中在上清液中。基于III型CRISPR的RNA浓度增加了环寡腺苷酸、cA3和cA4的水平。 此外，另一个由cA4激活的III型CRISPR系统（TtCsm6）以前被重新用于实时荧光读出，以检测病毒RNA。 据推测，基于Csm的RNA富集介导的cA4水平升高可以提高TtCsm6的活性，从而提高敏感性。 为此，研究人员将SARS-CoV-2的核衣壳（N）基因RNA（靶标）滴定到从HEK 293T细胞分离的总RNA（非靶标）中，以获得基于TtCsmCsm3-D34A浓度的靶标RNA，然后转移到TtCsm6和荧光RNA reporter的反应混合物中。基于Csm的RNA富集将检测灵敏度提高了100倍，表明III-A型CRISPR复合物可以捕获序列特异性RNA，提高环核苷酸水平，并提高RNA检测的灵敏度。 一些Csm家族蛋白质中的CRISPR相关Rossman折叠（CARF）结构域形成同源二聚体，并与cA4或cA6结合，激活高等真核生物和原核生物核苷酸结合（HEPN）结构域。然而，在一些Csm6蛋白质中，CARF结构域会降解使核酸酶失活的环核苷酸。 为了克服这个限制，研究人员探索了不降解cA4的CARF核酸酶。该团队在五种环状寡腺苷酸的存在下测试了嗜热T.菌（TtCan1）的CRISPR辅助核酸酶1（Can1）对质粒脱氧RNA（DNA）的核酸酶活性，并观察到cA3和锰离子（Mn+2）的强烈降解。进一步的研究表明，TtCan1是一种双链脱氧核糖核酸酶（DNase），被cA3激活时没有任何序列特异性，如果被cA4激活则为ssRNase。同样地，来自古细菌JdFR-42（AaCan2）的Can2被发现在cA3和Mn+2存在时是一种双链DNA酶，在cA4和Mn+2或镁离子（Mg+2）存在时是一种ssRNase。 接下来，TtCan1和AaCan2都切割相同的合成RNA，但是TtCan1介导的切割需要更高水平的cA4，并且产生的荧光信号比AaCan2弱。发现当被20倍少量的cA4激活时，AaCan2诱导与TtCsm6类似的荧光信号。因此，将AaCan2与TtCsmCsm3-D34A偶联可提高RNA检测的灵敏度。 最后，测试来自17个SARS-CoV-2阳性和6个SARS-CoV-2阴性个体的鼻咽拭子，以观察TtCsm复合物是否可以捕获总提取的RNA。具有高水平病毒RNA的样品，即循环阈值（Ct）>17，对于TtCsm-AaCan2反应是阳性的。当基于Csm的RNA捕获方法对其进行补充时，观察到灵敏度提高了100倍。此外，研究了TtCsm复合物是否可以直接从拭子中捕获RNA而无需RNA提取。当在基于TtCsm6的荧光测定中用Triton X-100和egtazic acid（EGTA）作为裂解缓冲液处理拭子样品时，TtCsm复合物检测到RNA。最后，用TtCsm-AaCan2测定法测试，该方法检测到每微升5×104个RNA拷贝。 研究人员开发的这种技术，使用RNase-dead的TtCsmCsm3-D34A复合物, 从未加工的样品中捕获和浓缩序列特异性RNA。然而，该测定的灵敏度仍然与快速抗原检测相当，并且不能与qPCR诊断测试的灵敏度相匹配。 这需要更多的研究来应用III型CRISPR系统，减少RNA提取步骤，优化裂解缓冲液，开发出新的下一代读出方法，以提高灵敏度，并缩短测定结果的时间。 相关阅读 Magigen T7核酸内切酶I / T7 Endonuclease I Magigen耐高温RNase HII-核糖核酸酶 - rhPCR好帮手！ Magigen LAMP试剂盒 - 环介导恒温扩增技术典范 Magigen一步法RT-qPCR预混液试剂盒-轻松搞定反转录qPCR |