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利用CRISPR技术直接快速检测新冠病毒RNA

作者:Magigen

来自美国蒙大拿州立大学的研究人员开发了一种基于CRISPR的诊断技术,用于检测COVID-19新冠病毒的核糖核酸(RNA)。

尽管定量聚合酶链反应qPCR检测非常可靠,是检测核酸的金标准,但它需要训练有素的人员、精密的设备、高效的样本处理和较长的周转时间。

由于冠状病毒COVID-19大流行的原因,我们迫切需要开发易于分发、易于执行和快速的诊断方法。目前,人们可以通过快速抗原检测和等温扩增方法来解决,但它们的敏感性、特异性或多功能性存在一些局限性。CRISPR RNA引导的诊断方法是可以解决当前局限性的新兴技术。

蒙大拿州立大学研究人员开发了一种基于CRISPR的诊断方法,用于从各种样本中聚合和获取SARS-CoV-2 RNA的特异性序列。

III型CRISPR RNA引导复合物,如Cmr和Csm,结合并切割互补单链(ss)RNA。将来自嗜热热菌(TtCsmCsm3-D34A)的突变体(D34A)、核糖核酸酶(RNase)-dead, III型-A CRISPR复合物(Csm3)与放射性标记(32P或32P)靶向RNA和非靶向RNA混合培养,以提高灵敏度,并测试其是否能聚集序列特异性RNA。

研究人员观察到,大多数(76±5.8%)32P标记的靶向RNA被复合物捕获,而非靶向RNA集中在上清液中。基于III型CRISPR的RNA浓度增加了环寡腺苷酸、cA3和cA4的水平。

此外,另一个由cA4激活的III型CRISPR系统(TtCsm6)以前被重新用于实时荧光读出,以检测病毒RNA。

据推测,基于Csm的RNA富集介导的cA4水平升高可以提高TtCsm6的活性,从而提高敏感性。

为此,研究人员将SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因RNA(靶标)滴定到从HEK 293T细胞分离的总RNA(非靶标)中,以获得基于TtCsmCsm3-D34A浓度的靶标RNA,然后转移到TtCsm6和荧光RNA reporter的反应混合物中。基于Csm的RNA富集将检测灵敏度提高了100倍,表明III-A型CRISPR复合物可以捕获序列特异性RNA,提高环核苷酸水平,并提高RNA检测的灵敏度。

一些Csm家族蛋白质中的CRISPR相关Rossman折叠(CARF)结构域形成同源二聚体,并与cA4或cA6结合,激活高等真核生物和原核生物核苷酸结合(HEPN)结构域。然而,在一些Csm6蛋白质中,CARF结构域会降解使核酸酶失活的环核苷酸。

为了克服这个限制,研究人员探索了不降解cA4的CARF核酸酶。该团队在五种环状寡腺苷酸的存在下测试了嗜热T.菌(TtCan1)的CRISPR辅助核酸酶1(Can1)对质粒脱氧RNA(DNA)的核酸酶活性,并观察到cA3和锰离子(Mn+2)的强烈降解。进一步的研究表明,TtCan1是一种双链脱氧核糖核酸酶(DNase),被cA3激活时没有任何序列特异性,如果被cA4激活则为ssRNase。同样地,来自古细菌JdFR-42(AaCan2)的Can2被发现在cA3和Mn+2存在时是一种双链DNA酶,在cA4和Mn+2或镁离子(Mg+2)存在时是一种ssRNase。

接下来,TtCan1和AaCan2都切割相同的合成RNA,但是TtCan1介导的切割需要更高水平的cA4,并且产生的荧光信号比AaCan2弱。发现当被20倍少量的cA4激活时,AaCan2诱导与TtCsm6类似的荧光信号。因此,将AaCan2与TtCsmCsm3-D34A偶联可提高RNA检测的灵敏度。

最后,测试来自17个SARS-CoV-2阳性和6个SARS-CoV-2阴性个体的鼻咽拭子,以观察TtCsm复合物是否可以捕获总提取的RNA。具有高水平病毒RNA的样品,即循环阈值(Ct)>17,对于TtCsm-AaCan2反应是阳性的。当基于Csm的RNA捕获方法对其进行补充时,观察到灵敏度提高了100倍。此外,研究了TtCsm复合物是否可以直接从拭子中捕获RNA而无需RNA提取。当在基于TtCsm6的荧光测定中用Triton X-100和egtazic acid(EGTA)作为裂解缓冲液处理拭子样品时,TtCsm复合物检测到RNA。最后,用TtCsm-AaCan2测定法测试,该方法检测到每微升5×104个RNA拷贝。

研究人员开发的这种技术,使用RNase-dead的TtCsmCsm3-D34A复合物, 从未加工的样品中捕获和浓缩序列特异性RNA。然而,该测定的灵敏度仍然与快速抗原检测相当,并且不能与qPCR诊断测试的灵敏度相匹配。

这需要更多的研究来应用III型CRISPR系统,减少RNA提取步骤,优化裂解缓冲液,开发出新的下一代读出方法,以提高灵敏度,并缩短测定结果的时间。


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