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逆转录PCR/RT-PCR的原理、实验步骤和参数设置

什么是逆转录PCR?

逆转录PCR, 又称反转录PCR,英文Reverse Transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应PCR的一种变形。

注意:实时PCR的简称也是RT-PCR, 注意区别。本文所指的RT-PCR是逆转录PCR.

在逆转录RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。


逆转录PCR(RT-PCR)的原理

逆转录PCR(RT-PCR)灵敏性高、操作简单点,经常用于生物学检测、基因定量分析、克隆目的基因等。

逆转录RT-PCR原理图

图1. 逆转录RT-PCR原理图


cDNA的合成是RT-PCR的重要环节。以mRNA为模板,在逆转录酶的催化下,随机引物、oligo(dT)或基因特异性引物的引导下合成互补的DNA( complementary DNA,cDNA),再按照普通PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,则可扩增出不含内含子的可编码完整基因的序列。


由于不同mRNA拷贝成cDNA的效率不同,适合于一种mRNA拷贝的条件可能对另一种mRNA不适合,需要有不同的配置。一般来说,从事不均一mRMA群体时,所使用的条件目的是让cDNA合成的终产量达到**。为此,下述参数十分重要。

逆转录PCR主要参数设置

1. 逆转录酶,有两种不同的逆转录酶可以催化以mRNA为模板,oligo(dT)作为引物,合成与mRNA互补的cDNA链。

    A. 来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV),由两条肽链组成,具有聚合酶活性和很强的rna酶H活性,它最适温度是42℃,最适pH8.3。在高反应温度时可消除mRNA的二级结构对逆转录的阻碍,然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA产生也限制其长度。另外,禽源逆转录酶制剂可被能切割DNA的核酸内切酶污染。

     B. 来源于鼠白血病病毒(Mo-MLV),是单肽链的,有RNA聚合酶活性和相对较弱的RNA酶H活性,最适温度37℃,最适pH7.6,较弱的RNA酶H活性对获得2-3kb的mRNA的全长cDNA有很大好处。在**链反应前可用氢氧化甲基汞处理,破坏mRNA的二级结构,这一步对于最适反应温度较低(37)℃的鼠源逆转录酶催化的反应可能更为重要。临合成cDNA**链之前加入过量的巯基试剂,可以使氢氧化甲基汞从RNA上解离。

2. 单价阳离子, 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。用钾比用钠离子可获得较长的转录产物。对于cDNA长度的最适钾离子浓度为140-150mM。

3. 二价阳离子, 对于反转录酶活性来说,二价阳离子是必需的。低于4mM Mg2未能观察到活性; 产生全长转录产物的最适浓度是6-10mM。

二价阳离子.jpg

4. 脱氧核苷三磷酸, 使用四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)中每一种的高浓度对于有效合成cDNA是特别重要的。如果其中只有一种的浓度下降到10-50微摩尔以下,全长转录物的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-250微摩尔。


逆转录PCR实验步骤

1.材料: RNA样品。

2.仪器、用具: PCR仪、电泳仪等、0.2mlPCR管(1个)、移液器、碎冰。

3.试剂: RNase Free dH2O;5×RT Buffer(含25mM Mg2);dNTP(10mM each);RNase Inhibitor(10U/μl);Oligo(dT)20(10μmol/L);ReverTra Ace。

4.方法

(1)以总RNA为模板,合成cDNA**链。

(2)反转录反应条件为:30℃10min,42℃30min,99℃5min,4℃5min。反应结束后冰浴5分钟。

PCR原理2.jpg

5. 逆转录PCR注意事项

cDNA**链合成的反应液冰上配制。

使用ReverTra Ace、RNase Inhibitor等酶类时,应轻轻混匀,避免起泡;由于酶保存液中含有50%的甘油,粘度高,分取时应慢慢吸取。

逆转录PCR时,提取RNA是关键,收集RNA沉淀时,离心速度不要低于13000rpm,在离心前的沉淀也尽可能在低温下条件下操作,此外逆转录酶可以选择MMLV逆转录酶,主要是因为这个条件比较容易掌握。


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