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CRISPR CAS蛋白的gRNA序列的设计流程

作者:Magigen

CRISPR Cas蛋白系统是细菌和古细菌在长期进化形成的一种免疫防御系统,可用来对抗入侵的病毒或者外源DNA。

目前,发现的CRISPR CAS系统根据不同的识别和切割的分子机制被分为了3大类,主要包括单一Cas蛋白、多cas蛋白相互作用、靶向DNA或者RNA等。

第1类CRISPR系统需要单一Cas蛋白,包括第II、V、VI型Cas蛋白。

而第2类利用多种Cas蛋白,包括第I、III、IV型Cas蛋白。

这些CRISPR Cas蛋白利用RNA引导, 靶向、切断、并降解外来入侵的DNA。哺乳动物细胞中常用的用于基因编辑的Cas蛋白酶包括II型化脓性链球菌SpCas9、较小的金黄色葡萄球菌SaCas9,还有V型Cas12a蛋白(又称Cpf1)。在II型CRISPR系统中,crRNA与反式激活tracrRNA形成复合物(称向导RNA,gRNA),靶向Cas9蛋白从而切断DNA中的特定位点。

CRISPR基因编辑应用中,gRNA中包含了一个与基因组DNA靶点互补的20 bp序列,靶点附近有一个前间区序列邻近基序,简称PAM,它将Cas9蛋白定位到该位点,从而在DNA中产生双链断裂DSB。CRISPR Cas9蛋白切割后产生的DSB主要通过两种机制进行修复:一种是细胞内源性的非同源端连接修复机制NHEJ,可以导致小的插入或删除(indels),另一种通过同源定向修复HDR,添加外源性模板,产生新的DNA。

有同学经常问美格君,如何设计有效的gRNA序列?gRNA设计流程是怎样的?

美格君就利用CRISPR/Cas9基因编辑人源细胞的P53基因来展示如何设计gRNA序列。

现在网上有一些设计gRNA的软件。这里我们利用张峰实验网站上的软件来设计P53的sgRNA序列。

gRNA设计流程:

1. 先在NCBI网站上查询并下载TP53基因组序列。

   登录NCBI网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

NCBI


2. 查询限定物种的目标基因

NCBI3. 搜索目标基因基本信息

4. 下载P53基因基因组序列,复制目标编辑位点序列信息。

5. 登录张锋实验室的网站。网站地址:https://zlab.bio/guide-design-resources

6. 找到 TOOLS FOR GUIDE DESIGN

7. 点击选择 CRISPOR,出现如下界面


GRNA设计8. 按照提示的步骤进行下一步操作。

9. 根据之前从NCBI下载的P53基因组序列信息,复制需要进行RNA编辑的目标区域序列,并粘贴到Step1中,在step2中选择物种信息,在step3中选择实验室常用到cas9蛋白和PAM序列NGG要的选项,然后点击SUBMIT提交。

10. 根据网站设计不同的gRNA,选取合适和评分最高的gRNA即可出。

11. 最后在设计好的gRNA序列的5'端点引入酶切位点,合成单链的正反向序列,酶切链接到建好表达载体上, 载体有相同酶切位点。


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